肿瘤干细胞在人结肠癌细胞株HT29耐奥沙利铂中作用探析.docVIP

肿瘤干细胞在人结肠癌细胞株HT29耐奥沙利铂中作用探析 　　[摘要] 目的 探讨肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）在人结肠癌细胞株HT29对奥沙利铂（L-OHP）产生获得性耐药中的作用。 方法 采用浓度递增法诱导产生人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HT29/L-OHP。采用As2O3逆转HT29/L-OHP的耐药性。采用MTT法检测As2O3逆转前后HT29/L-OHP的增殖能力和对L-OHP的敏感性。采用实时荧光定量PCR检测As2O3逆转前后HT29/L-OHP中Sox-2、miR-200c和let-7的表达。 结果 ①在L-OHP（12 μmol/L） 的作用下，HT29/L-OHP的增殖能力显著高于HT29（P 0.05）。HT29和HT29/L-OHP对L-OHP的IC50分别为12.1 μmol/L和138.4 μmol/L，耐药指数为11.44。②0.20 mg/L 的As2O3预处理后，降低了HT29/L-OHP对L-OHP的耐药性，逆转倍数为3.76，相对逆转效率为80.4%。③相对于HT29，HT29/L-OHP中Sox-2的表达显著增加[（0.072±0.038）比（0.019±0.010）]（P 　　1.2.7 As2O3对HT29/L-OHP细胞耐药性的逆转 根据细胞毒性实验结果，选取无细胞毒剂量的As2O3进行实验。加入As2O3 72 h后测定HT29/L-OHP细胞对L-OHP的敏感性，计算IC50，并计算逆转倍数和相对逆转效率。逆转倍数=HT29/L-OHP 的IC50/加入As2O3后HT29/L-OHP 的IC50。相对逆转效率=（HT29/L-OHP逆转前IC50- HT29/L-OHP逆转后IC50）/（ HT29/L-OHP逆转前IC50- HT的IC50）。 1.2.8 实时荧光定量PCR 1.2.8.1 引物设计 采用引物在线软件设计引物并检测分析（blast.ncbi.nlm.nih.gov），最后由上海生物工程有限公司合成，引物序列（5’→3’）见表1。 1.2.8.2 总RNA的提取和逆转录 取对数生长期的耐药株和亲本株HT29细胞，采用RNA提取试剂盒提取总RNA并进行逆转录反应，得到的cDNA用于实时荧光定量PCR。 1.2.8.3 实时荧光定量PCR反应 反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM （2×） 10 μL，Forword primer 0.4 μL，Reverse primer 0.4 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，cDNA 2 μL，dH2O 6.4 μL。反应条件：95℃变性15 min，扩增40循环，每循环变性15 s，60℃退火30 s，72℃ 30 s。采用△△Ct法进行相对定量分析。 1.3 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件包进行数据处理，计量资料进行方差齐性分析和正态分布检验，方差齐且呈正态分布的数据，组间比较采用单因素方差分析；方差不齐或者非正态分布数据均进行变量变换，变换后再进行方差齐性分析和正态分布检验，若变换后仍方差不齐或者非正态分布的数据，对其进行非参数检验。以P 0.05），但是在第3～7天，HT29/L-OHP细胞增殖速度显著高于HT29细胞（P 0.05）（图1），HT29/L-OHP细胞的倍增时间接近于无L-OHP作用的HT29细胞（26.3 h）。MTT结果显示，HT29/L-OHP细胞的IC50为138.4 μmol/L，HT29细胞的IC50为12.1 μmol/L，RI为11.44。 2.2 As2O3细胞毒性实验结果 结果表明，0.25 mg/L的As2O3对HT29细胞无毒性反应，但是当浓度超过0.25 mg/L时，As2O3呈现出剂量依赖性的毒性效应（表2），可以认为0.20 mg/L的As2O3为无细胞毒性剂量。 2.3 As2O3对HT29/L-OHP细胞耐药性的逆转 As2O3（0.20 mg/L）预处理后，MTT结果显示，在L-OHP（12 μmol/L）存在的情况下，在第1～5天时，HT29/L-OHP和HT29细胞的增殖速度差异无统计学意义（P 0.05，图2），但是在第6、7天，HT29/L-OHP细胞增殖速度显著高于HT29细胞（P 0.05，图2），但是在第3～7天，HT29/L-OHP细胞的增殖速度降低（P 　　多项研究表明，CSC是多种肿瘤细胞产生化疗药物耐药性的重要机制之一[7-8]，但是CSC在结肠癌细胞对L-OHP耐药中的作用并不清楚。为了探讨CSC是否参与了结肠癌细胞的耐药过程，本研究采用实时荧光定量PCR观察了与干细胞相关的标记物的