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针对HP450基因shRNA真核表达载体质粒转染 　　[摘要] 目的 以pGPH1/GFP/Neo质粒为载体，构建特异性针对HP450基因shRNA真核表达载体，并通过脂质体介导转染正常的大鼠肝细胞株（BRL），以探讨靶向干扰HP450基因对BRL细胞生长的影响。 方法 构建pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表达载体。应用脂质体转染技术，将重组的pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表达载体转染至大鼠肝细胞株（BRL），并于转染后6、12、24 h在荧光倒置显微镜下观察细胞状态。 结果 成功构建针对HP450基因shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450，通过脂质体介导转染大鼠肝细胞株BRL，在荧光倒置显微镜下可观察到细胞转染后的荧光现象。 结论 成功构建的HP450 shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450，可通过质粒转染方法转染至BRL细胞。 [关键词] HP450基因；质粒转染；BRL细胞株 [中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）10（b）-0004-03 原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，过去尽管综合应用手术、放化疗等多种治疗手段，但患者生存率并无明显改善，也未能从根本上解决肝癌转移和复发的问题[1]。随着分子生物学、细胞生物学等学科的飞速发展，肿瘤生物治疗越来越受到重视。 抗组胺药敏感性细胞色素P450（简称HP450）主要存在于肝脏微粒体，HP450在肝脏疾病发展过程中具有一定的规律性和相关性[2-4]，有可能作为肝癌诊断的一个新指标和治疗肝癌的一个新靶点。 本实验以HP450基因作为研究靶点，利用先进的RNAi技术，构建shRNA真核表达载体，将该载体经脂质体转染大鼠正常肝细胞株BRL，研究质粒转染后对HP450基因表达及BRL细胞增殖的影响，为今后研究HP450基因对BRL细胞功能的影响提供实验基础。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 1.1.1 仪器设备 超净工作台（AIRTECH公司）、5% CO2恒温培养箱（美国BIO-RAD公司）、倒置相差显微镜（日本奥林巴司公司）、大容量冷冻高速离心机（德国Eppenndorf Centrifuge公司）、-80℃超低温保存箱（海尔公司）、电热恒温水浴箱（上海精宏实验设备有限公司）、AB204-E分析天平（瑞士梅特勒一托利多公司）、紫外可见分光光度计（Thermo基因有限公司）、SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）、电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）、高压灭菌消毒锅（日本TOMY公司）、微量移液器（德国Eppendorf公司）、微波炉（广东格兰仕家电集团）。 1.1.2 细胞培养材料 大鼠肝细胞株BRL购自中国科学院上海细胞库。DMEM培养基（美国Hyclone公司，批号：SH30022.01B）、二甲基亚砜（DMSO，上海市欣诚化工有限公司，批号：CAS：67-68-5）、磷酸盐缓冲液（PBS，北京索莱宝生物科技有限公司，型号：H1045）、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（北京索莱宝生物科技有限公司，型号：T1300）、胎牛血清（杭州四季青公司，型号：HB0205）。 1.1.3 质粒转染材料 pGPH1/GFP/Neo质粒购自上海吉玛制药技术有限公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，No.11668-027。 1.1.4 RT-PCR引物设计材料 根据H1 mRNA全长序列（GeneBank ID：24448），由广州GeneCopoeia公司设计合成，扩增产物片段大小为154 bp，引物序列如下：上游：5’-ttcttctccttcctgtgggtta-3’（Lenth：22，Tm：61.9，GC：60）； 下游：5’-tcctacactggggtctcttgat-3’（Lenth：22，Tm：61.9，GC：60）。内参引物F18由上海生工生物工程有限公司合成，扩增产物片段大小为207 bp，序列如下：上游：5’-cacccgcgagtacaaccttc-3’（Lenth：20，Tm：60.7，GC：50）；下游：5’-cccatacccaccatcacacc-3’（ Lenth：22，Tm：60.07，GC：50）。 1.1.5 试剂的配置 ①PBS缓冲液：将PBS干粉倒入干净的烧杯中，加入2000 mL三蒸水，用玻棒稍搅拌后，放入磁力搅拌子，转移烧杯至磁力搅拌器上，调整合适转速，5 min左右即可完全溶解。之后用pH计测量其pH值，如若pH值未在预定范围中，用NaOH或浓HCl将其pH值调至7.2～7.4，分装入容量为50