圆二色性测定蛋白质的空间结构.ppt

一 基本原理 （一）几种偏振光的概念 1.平面偏振光 如有一束光，它所有的电矢量（或磁矢量）的振动平面都是相互平行的，这种光称为平面偏振光。 2 圆偏振光 对着光前进的方向观察时，一束光波的电场矢量（或磁场矢量）端点在空间的轨迹是以光传播方向为轴的圆形螺旋（在平面上的投影为圆形）。 电矢量方向沿逆时针方向旋转，称为左圆偏振光 电矢量方向沿顺时针方向旋转，称为右圆偏振光 3 椭圆偏振光 对着光前进的方向观察时，一束光波的电场矢量（或磁场矢量）端点在空间的轨迹是以光传播方向为轴的椭圆形螺旋（在平面上的投影为椭圆形）。 （二）几种偏振光的关系 振幅不相等、 角频率相等左右圆偏振光合成椭圆偏振光 振幅相等、 位相差1/4波长 两束线偏振光合成圆偏振光 二 蛋白质的圆二色性及其测量 （一）蛋白质的圆二色性 蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子。蛋白质一般有一级结构、二级结构、超二级结构、结构域、三级结构和四级结构几个结构层次。在蛋白质或多肽中，主要的光活性基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键。当平面圆偏振光通过这些光活性的生色基团时，光活性中心对平面圆偏振光中的左、右圆偏振光的吸收不相同，产生的吸收差值，由于这种吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圆偏振光变成了椭圆偏振光，这就是蛋白质的圆二色性。 （二）CD测量的样品准备及条件选择 由于CD是一种定量的、灵敏的光谱技术。测试用的蛋白质样品中应避免含有光吸收的杂质，缓冲剂和溶剂在配制溶液前最好做单独的检查，透明性极好的磷酸盐可用作为缓冲体系。 蛋白质最佳浓度的选择和测定，决定CD数据计算二级结构的准确性。CD光谱的测量一般在蛋白质含量相对低（0.01～0.2g/L）的稀释液中进行。 真空紫外CD谱的测试要求很高，光路必须使用大通量、高纯度氮气洗涤，一般选用0.05～1mm的圆形石英测试池，以减少光吸收。 （二）CD数据拟合计算蛋白质二级结构 （三）圆二色数据分析蛋白质的三级结构 （四）圆二色仪光路图 （五）圆二色仪的组成部分 光源 疝气 起偏器 尼科耳棱镜：天然方解石，Rochon棱镜：结晶状英石 调制解调器（CMD） 在其上施加几万赫兹的高频交变电压，作用是将单色的平面偏振光以这种频率交替的变为左、右旋圆偏正光。 光电倍增管（PM） 样品杯 氮气保护装置 * * 圆二色性测定蛋白质的空间结构 4 自然光 对着光前进的方向观察时，一束光波的电场矢量（或磁场矢量）取所用可能方向，没有一个方向较其它方向占有优势。 振幅相等、 角频率相等、相位相同 左右圆偏振光合成线性偏振光 振幅相等、 角频率相等、 相位不同 左右圆偏振光合成线性偏振光 （三）圆二色性 手性物质对左右圆偏振光的吸收程度不同，出射时电场矢量的振幅不同通过样品后，再次合成的偏振光就不是圆偏振光，而是椭圆偏振光。 蛋白质的CD光谱一般分为两个波长范围，178～250nm为远紫外区CD光谱，250～320nm为近紫外区CD光谱。 MOS-450 多功能圆二色光谱仪 J-815 圆二色光谱仪