真核表达载体pcDNA3.1—Beclin1构建和其对子宫内膜癌HEC细胞增殖影响.docVIP

真核表达载体pcDNA3.1—Beclin1构建和其对子宫内膜癌HEC细胞增殖影响 　　【摘要】 目的：构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1，检测人子宫内膜癌HEC细胞转染pcDNA3.1-Beclin1后，外源性基因Beclin1在蛋白水平的表达，并观察其对HEC细胞增殖的影响。方法：通过RT-PCR和T/A克隆等方法，构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1，并通过脂质体介导的方法将外源性Beclin1基因导入人类子宫内膜癌细胞株HEC中，通过实时PCR检测转染后Beclin1在HEC中表达的情况，并设立实验组（转染pcDNA3.1-Beclin1真核载体）、空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、空白脂质体对照组，用Western blot法检测子宫内膜癌HEC细胞中Beclin1的表达情况，MTT法检测Beclin1对HEC细胞体外生长的影响等，研究Beclin1基因与子宫内膜癌的关系。结果：经限制性内切酶鉴定及测序，证明Beclin1基因真核质粒的序列完全正确，将其转染HEC细胞，转染后的HEC细胞在体外能继续增殖，但增殖能力明显下降。结论：Beclin1基因pcDNA3.1-Beclin1真核表达载体构建成功，并能在HEC细胞中表达，转染HEC细胞体外增殖能力明显降低，Beclin1基因用于子宫内膜癌基因治疗具有重要靶向价值。 【关键词】 Beclin1； 真核表达载体； 细胞； 增殖 子宫内膜癌（EC）是仅次于乳腺癌和宫颈癌的常见女性生殖系统恶性肿瘤，占女性生殖系统恶性肿瘤的20%～30%[1]。其发病率每年10万人约有24.6人，在我国近二十年来也呈逐年上升趋势，但其发生、发展机理仍不十分明确。多数学者认为其发生发展与雌激素水平密切相关[2]。长期无拮抗的雌激素刺激可能是主要发病因素，在实验动物中可观察到雌激素引起子宫内膜有丝分裂增多的现象。 Beclin1是一种与自噬相关的抑癌基因，位于人染色体17q21上，在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌中该部位均存在缺失。有研究提示Beclin1的表达缺失导致自噬活性的减弱从而促进肿瘤的发生，故Beclin1在雌激素依赖性肿瘤子宫内膜癌的发生发展中起着重要的作用。因此，本研究旨在构建Beclin1真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1，建立稳定表达Beclin1的细胞株，探讨Beclin1在子宫内膜癌细胞增殖中的影响，以期对子宫内膜癌基因治疗提供科学的依据，对内膜癌的发生发展关系的研究能进一步深入奠定实验基础。 1 资料与方法 1.1 一般资料 高效真核表达载体pcDNA3.1质粒购自Oligoengine公司；G418和Lipofectamine2000购自Invivogen公司；BglⅡ、EcoRI、Hind Ⅲ、T4DNA链接酶、TaqDNA聚合酶和DL2000DNA分子量标记购自北京天根生物有限公司；琼脂凝胶回收试剂盒、质粒提取纯化试剂盒、RNA抽提及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒购自Fermentas公司，兔抗人Beclin1多克隆抗体购自大连宝生物公司，所有DNA序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；人子宫内膜癌细胞HEC-1-B购自中国医学科学院上海细胞库，实验涉及各种酶类为NEB产品，嘌呤霉素为sigma产品，胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物制品公司。 1.2 方法 1.2.1 引物设计和子宫内膜细胞Beclin1基因扩增 在NCBI数据库中查找Beclin1的mRNA全序列，基因编号NM003766；根据其cDNA全长序列，参照国际流行标准，利用Invivogen公司的在线软件进行设计，选取编码区两侧的碱基合成相应的引物。上游引物序列（上游）5′-ATCCTGGACCGTGTCACCATACAGT-3′，（下游）5′-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGT-3′，分别含有EcoRI、Hind Ⅲ酶切点位，目的片段为326 bp。按T/A克隆操作规范，参照Trizol试剂盒说明书提取人子宫内膜癌细胞株HEC总RNA，利用蛋白核酸分析仪测定RNA纯度及浓度，通过1%琼脂糖电泳鉴定RNA完整性；取300 ng总RNA，根据RT-PCR试剂盒说明进行逆转录合成Beclin1DNA；PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min、55 ℃退火1.5 min、72 ℃延伸0.5 min，共30个循环，最后72 ℃再延伸6 min终止。取PCR最终产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，切取326 bp目的片段凝胶，利用试剂盒回收纯化目的片段。 1.2.2 构建Beclin1表达质粒 经EcoRI、HindⅢ双酶切后，再将插入片段定向插入