Caveolin—1与p42-p44MAPK在哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中作用.docVIP

Caveolin—1与p42/p44MAPK在哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中作用 　　[摘要] 目的 观察哮喘大鼠肺组织中Caveolin-1和p-p42/p44MAPK含量的变化，探讨Caveolin-1和p42/p44MAPK在哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用。 方法 2009年4月～2010年6月间选择SPF级雄性SD大鼠24只，随机分为对照组（C组）、哮喘组（A组）和地塞米松组（D组），每组8只。以卵白蛋白（OVA）致敏和激发的方法复制大鼠慢性哮喘模型。观察肺组织病理超微结构变化，以图像分析软件测定支气管壁厚度（wat/pbm）和支气管平滑肌厚度（wam/pbm），免疫组化法检测气道平滑肌Caveolin-1、p-p42/p44MAPK蛋白的表达。 结果 A组大鼠wat/pbm、wam/pbm大于C组（P 　　[Key words] Asthma； Rat； Airway remodeling； Caveolin-1； p42/p44MAPK 气道重塑是哮喘的重要病理特征。气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）的增生和肥大在哮喘气道重塑中发挥了重要的作用，已成为目前哮喘治疗的新标靶[1]。Caveolae最早于1950年发现于心脏内皮，后在多数细胞类型和组织的质膜中亦发现其存在。Caveolae常呈50～100 nm大小ω形，其形态依赖于细胞的生理状态[2]。Caveolin-1是Caveolae的主要结构蛋白，分为α、β两个亚型，其中心疏水结构域（102～134位残基）构成其跨膜结构域，并通过N-末端膜附着结构域和C-末端膜附着结构域与膜结合。Caveolin-1在其C-末端134、144、157位有三个棕榈酰化的半胱氨酸残基，对Caveolin向细胞膜的转运及与胆固醇的结合起重要作用[3]。Caveolin-1可以减少气道平滑肌细胞的生长、负性调节气道平滑肌增殖[4]。p42/p44MAPK信号转导途径是体内多条信号途径的交点，在哮喘气道发挥了重要作用[5]。Sathish等[6]发现Caveolin-1通过调节细胞因子等对气道炎症有重要作用。本研究通过复制大鼠哮喘气道重塑模型，研究Caveolin-1、p42/p44MAPK的变化，并给予地塞米松干预，探讨Caveolin-1、p42/p44MAPK对哮喘大鼠气道重塑的影响，及其在哮喘ASMCs增殖中的作用。 1 材料与方法 1.1 实验材料 2009年4月～2010年6月间选择SPF级雄性SD大鼠24只，4～6周龄，体重100～120 g，由温州医学院实验动物中心提供；OVA（V级），购自美国Sigma公司；Caveolin-1兔抗大鼠多克隆抗体，购自杭州华安生物技术有限公司；phospho-p42/p44MAPK抗体，购自海门市碧云天生物技术研究所；兔SP检测试剂盒、鼠SP检测试剂盒，购自北京中杉生物技术有限公司；地塞米松磷酸钠注射液，购自江苏涟水制药有限公司。 1.2 实验方法 1.2.1 哮喘大鼠气道重塑模型复制 将24只健康雄性SD大鼠按随机数字表分为对照组（C组）、哮喘组（A组）和地塞米松组（D组），每组8只。参照Temelkovski等[7]及Palmans EJC等[8]的方法制备大鼠哮喘模型。对照组（C组）则代以生理盐水致敏和激发大鼠；地塞米松组（D组）致敏阶段同哮喘组，激发阶段在每次激发前半小时予地塞米松0.5 mg/kg腹腔注射，同时其余各组激发前生理盐水腹腔注射。末次激发后24 h内取得肺组织标本备用。 1.2.2 肺组织显微结构观察及支气管壁厚度和支气管平滑肌厚度测定 HE染色法制作肺组织病理标本，观察各组肺组织结构、炎性浸润、支气管壁有无增厚等情况。采用图像分析软件（Image-Pro Plus Version 6.0）分别测量支气管基底膜周径（pbm）、支气管管壁总面积（wat）、支气管平滑肌面积（wam）。并用pbm将测得的wat、wam标准化，以wat/pbm、wam/pbm分别代表管壁厚度和平滑肌厚度。 1.2.3 免疫组化法测定支气管平滑肌Caveolin-1、p-p42/p44MAPK蛋白含量 肺组织石蜡包埋切片，脱蜡、水化，3%过氧化氢消除过氧化氢酶活性，微波修复抗原，胎山羊血清封闭，滴加一抗Caveolin-1兔抗大鼠多克隆抗体（1∶75稀释）或p-p42/p44抗体（1∶50稀释），4℃过夜，采用SP法，二氨基联苯胺显色，苏木素复染、脱水、透明、封片。PBS代替一抗作为阴性对照。阳性表达呈棕黄色。每张切片随机选择5个高倍镜下支气管切面（×400），以气道平滑肌层为分析对象，应用IPP6.0图像分析软件测定阳性部位的平均吸光度