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R2工程细菌纤维素酶酶活影响条件探析 　　摘要：以3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力，研究了不同浓度的表面活性剂（Tween 80）、不同缓冲液、不同pH对R2工程细菌纤维素酶酶活的影响。结果表明，在35 ℃、Tween 80浓度为1.6%、醋酸-醋酸钠缓冲液pH 4.8的条件下纤维素酶酶活最高， 是对照的1.47倍。 关键词：纤维素酶；Tween 80；pH；表面活性剂；缓冲体系 中图分类号：Q935 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）18-4486-03 纤维素是地球上数量最大的可再生资源，也是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物[1]。纤维素是经β-1，4葡萄糖苷键连接而成的直链高分子，具有很强的结晶性，糖苷键能通过酶的催化作用发生水解。可以通过纤维素酶系来分解纤维素，使之转变为可被利用的D-葡萄糖，再进一步发酵为酒精，对开发新能源具有重要的意义[2]。 纤维素酶酶解反应过程主要受到温度和pH[3，4]等多方面因素的影响，同时表面活性剂可以使高分子聚合物变成复杂的亲水性化合物，使纤维素与纤维素酶有效结合，从而提高纤维素酶的酶解效率[5-7]。试验将表面活性剂、缓冲液和pH对纤维素酶酶活的影响进行了研究，以期得到纤维素酶适宜的酶解条件，更高效地转化和利用纤维素。 1 材料与方法 1.1 材料及仪器 卡那霉素、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、羧甲基纤维素钠（CMC）、Tween 80、3，5-二硝基水杨酸（DNS）、苯酚、CuSO4·5H2O、CaCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、葡萄糖均为分析纯；R2工程细菌由重庆理工大学药学与生物实验室提供[8]。 TGL-16M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；UV-2450紫外可见光光度计（优尼科仪器有限公司）；C型玻璃仪器气流烘干器（长城科工贸有限公司）；FE20实验室pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）；BS110S 电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；DZF-6051真空干燥箱（上海越众仪器设备有限公司）。 1.2 方法 1.2.1 R2工程细菌纤维素酶的分离纯化 将R2工程细菌在LB培养液中培养48 h后经IPTG诱导，将诱导后的培养液于5 ℃、5 000 r/min离心30 min，收集沉淀，往沉淀中加入10 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH 4.8），超声波破碎（功率300 W，间歇5 s，99次）。取一小滴菌液于载玻片上，草酸铵结晶紫染液染色，显微镜下观察破碎情况，直至无完整细胞。将完全破碎后的菌液装入离心管，5 ℃， 3 000 r/min离心15 min，上清液于-20 ℃保存[9，10]。 1.2.2 纤维素酶的鉴定和酶活的测定 CMC培养基鉴定纤维素酶[11]。DNS法测定纤维素酶活[12]。一个酶活力单位（U）定义为45 ℃、pH 4.8的条件下，每分钟催化CMC水解生成1 μg葡萄糖所需的酶量。 1.2.3 纤维素酶酶活最适缓冲液及pH的确定[12] 用醋酸-醋酸钠缓冲液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制1%的CMC溶液。在各试管中加入1.5 mL对应的1%的CMC溶液，再加入0.5 mL“1.2.1”中提取的酶液，用2 mL 1%的CMC溶液作对照；40 ℃水浴40 min后立即加入3 mL DNS试剂，沸水浴7 min后加入5 mL去离子水，冷却后测定吸光度。 1.2.4 纤维素酶最适温度的测定 取“1.2.1”中提取的酶液0.5 mL，加入CMC底物1.5 mL，在不同温度（15、30、35、40、45、50、55、60、70 ℃）反应30 min，加入3 mL DNS试剂，沸水浴7 min后加入10 mL去离子水，冷却后测吸光值。 1.2.5 纤维素酶酶活最适Tween 80浓度的确定[13] 取“1.2.1”中提取的酶液0.5 mL，加入CMC底物1.5 mL，再加入0.1 mL不同浓度的Tween 80溶液，45 ℃反应30 min后加入3 mL DNS试剂，沸水浴7 min后加入10 mL去离子水，冷却后测定吸光值。 2 结果与分析 2.1 标准曲线的绘制 根据羧甲基纤维素酶活力测定方法测定溶液中还原糖（葡萄糖）的含量，并以吸光值为纵坐标、葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线（图1）。标准曲线决定系数r2=0.994 8，可以用于纤维素酶活力的测定。 2.2 不同缓冲液及pH对纤维素酶酶活的影响 从图2可以看出，随着pH的升高纤维素酶酶活呈先上升后下降的趋势，合适的pH在4.0～5.5之间，最适pH为4.8，过酸、过碱的环境会影响酶和底物的稳定性，导致纤维素酶活