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不同牛种SOCS6基因5′调控区多态性研究 　　摘要：为筛选SOCS6基因启动子区域单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）并研究其对启动子功能元件的影响，选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建DNA池，直接测序筛选SNP位点。结果表明，SOCS6基因5′调控区存在4个SNP位点，分别为T-513G、C-401T、A-332G和T-180G。生物信息学软件预测得到SOCS6基因核心启动子区和CpG岛，SNP位点导致附近部分转录因子结合位点消失和新位点产生。多态性位点对转录因子结合位点有显著影响，但并不改变CpG岛大小。 关键词：细胞因子信号传导抑制子（Suppressor of cytokine signalling，SOCS）；单核苷酸多态性（SNP）；启动子；贵州荷斯坦奶牛；务川黑牛 中图分类号：S823.8；Q756 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）16-3991-04 细胞因子诱导SH2蛋白（Cytokine inducible SH2 protein，CIS）和细胞因子信号传导抑制子（Suppressor of cytokine signalling， SOCS）是细胞因子信号转导抑制蛋白的家族成员，对GH在内的细胞因子或生长因子通路起负调控作用[1-3]。SOCS6蛋白含有SH2（Src-homology 2）结构域、较长的N端结构域和C端SOCS box[4]，和其他SOCS蛋白不同，SOCS6蛋白N端结构域具有300个氨基酸结构[5]，SOCS6蛋白作为E3泛素连接酶，利用其SH2结构域与c-KIT蛋白pY568位点结合，与c-KIT作用抑制干细胞因子诱导细胞扩增[6]。SOCS6蛋白可能不与细胞因子信号途径中的细胞因子相互作用，不抑制细胞因子受体信号通路，但会减少STAT3蛋白水平[7]，而STAT3可作为转录因子调控与生长相关基因的表达。SOCS6转基因小鼠细胞因子信号通路和造血系统正常，但葡萄糖代谢水平提高，并出现生长迟缓现象[8]。 猪和人的SOCS6蛋白有92.3%的氨基酸同源性，SOCS6蛋白在猪多种组织中有相似表达，大肠、小肠内表达量较高[9]。对牛的SOCS6基因研究极少，基因启动子变异通过改变RNA聚合酶和转录因子与调控序列的结合来影响基因表达水平。本研究为筛选SOCS6基因启动子区单核苷酸的多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNP），研究其对启动子功能元件的影响，选择生长性能差异明显的务川黑牛和贵州荷斯坦奶牛构建DNA池，测序后用DNAStar软件进行序列拼接、校正，BLAST比对分析SOCS6基因多态性，将牛SOCS6基因启动子区筛选到的SNP位点与NCBI中SNP数据库进行比较，运用不同生物信息学软件预测核心启动子区和CpG岛，分析SNP位点对转录因子结合位点的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 贵州荷斯坦奶牛54个血样采自贵阳三联乳业公司第二奶牛场，务川黑牛45个血样采自贵州务川仡佬族苗族自治县仡佬牧业公司牛场。 1.2 方法 1.2.1 DNA的提取与DNA池的构建 使用血液基因组DNA提取试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取牛的基因组DNA，以1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品质量，使用紫外分光光度计测定DNA样品浓度，每个样品测3次，取平均值。将务川黑牛和贵州荷斯坦奶牛DNA样品浓度分别调至100 ng/μL，各取5 μL混合构建两个DNA池。 1.2.2 引物设计和PCR扩增 根据牛SOCS6基因（GenBank登录号：AC_000181.1）DNA序列，设计1对特异性引物扩增SOCS6基因5′调控区和第1外显子部分序列，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表1。PCR反应体系为25 μL：2×Taq PCR Master Mix试剂12.5 μL，上、下游引物（浓度为10 pmol/μL）各1.5 μL，基因组DNA 2.5 μL，ddH2O 7.0 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，60.6 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，纯化回收后的PCR产物送诺赛基因组研究中心有限公司测序。 1.2.3 生物信息学分析 生物信息学软件是根据数学模型或不同的算法来预测结果，不同的软件可能会因为计算方法或阈值设定差异而得到不同的预测结果，利用不同的软件进行比较分析可以最大限度地提高预测的准确性，充分发挥其参考价值。将突变序列分别递交在线软件进行预测，并对序列突变之后软件预测