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实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 实验目的 学习氨基酸纸层析的基本原理。 掌握氨基酸纸层析的操作技术。 实验原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。将样品点在滤纸上（原点），进行展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进行分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA分离开来，形成距原点距离不等的层析点。 溶质在滤纸上的移动速率用比移（rate of flow ,Rf）来表示 Rf= 原点到层析点中心的距离（X）/原点到溶剂前沿的距离(Y) 只要条件（如温度、展层剂的组成）不变，某种物质的Rf值是常数。可根据Rf作为定性依据。 Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。 样品中如有多种AA，其中有些AA的Rf值相同或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而达到分离的目的，这种方法叫双向层析。 仪器、试剂 1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进行混合得混合液。将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。 2、氨基酸溶液 ⑴.已知单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、 ⑵.混合氨基酸： 各5 ml混合。 3、显色剂 ：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。 4、层析缸、滤纸（14*17）、喷雾器、电吹风 实验步骤 1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。 2.准备滤纸：取层析滤纸（长17㎝、宽14㎝）一张。在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。 3.点样： 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这8个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。 4.扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20ml扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1㎝）。待溶剂上升12㎝时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 5.显色：用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟（100℃）或用热风吹干即可显出各层析斑点。 6.计算：计算各种氨基酸的比移（Rf）值。 精讲点播 1. 利用逆流分溶或逆流分配的方法作为分配层析原理的说明： 2.物质的结构与极性对Rf值的影响 物质的结构不同，其分子的极性不一样，物质在水和有机溶剂两相中的溶解度就不同，分配系数的不同可通过Rf值反应出来，极性较强的物质，在水中的溶解度较大，其Rf值就较小，相反极性较弱的物质，在有机溶剂中的溶解度就较大Rf值就大些，如中性AA的极性弱于酸碱性AA，故中性AA的Rf值较大。 注意事项、出现的问题及解决办法 1.取滤纸前，要将手洗净，并尽可能少接触滤纸，不得已时只能拿滤纸的一角，平放在洁净的纸上。 2.点样点的直径不能大于0.5㎝，否则分离效果不好，样品用量大会造成“拖尾巴”现象。 3.分离时间短使有些已知氨基酸的Rf值非常相似，分析时可以辅颜色不同加以区分。 4.样品在原点未移动，是因为展层剂出问题，在展层剂中混入了平衡溶液，因为平衡溶液是放置时间长了的展层剂，展层剂出现脂化现象，使分配系数发生变化。 思考题 1.何谓纸层析法？ 2.何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？ 3.怎样制备扩展剂？ 4.层析缸中平衡溶剂的作用是什么？ 实验二. 酶的特异性（专一性）及影响酶活性的因素 实验目的 掌握检查酶特异性的方法和原理。 了解温度对酶活性的影响。 了解激活剂、抑制剂对酶活力的影响。 实验原理 1. 酶的专一性 酶是生物体中一种具有催化功能的特殊蛋白质（传统酶的概念），也常称为生物催化剂。它与一般催化剂的最主要区别就是具有高度的特异性，即专一性。根据各种酶对底物的选择程度不同，可分为绝对专一性、相对专一性、立体异构专一性，。例如唾液淀粉酶属于相对专一性酶，它只能随机作用于淀粉链内部的a——1，4糖苷键，使其分子迅速断裂成较短的链，称为糊精，糊精分子量递减，淀粉——大分子糊精——中分子糊精——小分子糊精——简单分子糊精——麦芽糖和a——糊精（含a——1，6糖苷键的短链聚糖，平均分子量为8个残基）。 由于淀粉酶催化所形成的产物都是还原糖，故可用灵敏度较高的Benedict试剂检测和观察。 2.温度对酶促反应速度的影响 酶的催化作用受温度的