第七章分子生物学其它实验技术.docVIP

第七章其它技术 实验一 M13克隆和DNA序列分析 一、原理用途 DNA的序列分析是DNA分子克隆研究中最重要的方法之一，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA片段的操作方面，都有着十分广泛的实用价值。根据DNA序列，可以得知限制性酶切位点；可以了解蛋白质的编码区和上、下游调控序列，进而研究编码基因的表达；可以确定基因诱变后特异的碱基变化；在疾病基因诊断中，可提示疾病的分子缺陷，并确认某个位置的碱基突变，从而找出疾病发生的机制。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert（1977）发明的化学修饰法。这两种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、 G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前应用广泛的是M13噬菌体克隆-双脱氧核苷酸（ddNTP）的DNA测序法。 M13噬菌体克隆-双脱氧核苷酸（ddNTP）测序法的基本原理是：M13噬菌体是一种单链DNA噬菌体，但它在感染宿主（大肠杆菌）后，在菌体细胞内复制成为双链并繁殖，又以单链形式透出菌体，再度感染新的宿主菌。把一段待测DNA用遗传工程方法插入双链的M13复制型DNA中，经过培养扩增，在培养物的上清液中可以提取到单链的M13噬菌体的DN