转基因技术原理与方法.ppt

转基因熊猫狗 转基因技术 王海玲 2012.10.24 简介 转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术，其最终目的是将DNA片段转入为一个生物体，从而使该生物体具有表现某种性状。 转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现。 转基因打破了物种的界限，使不同种的生物的遗传物质在分子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，实现对生物体的改造。 转基因的方法和原理 目的基因制备和载体系统 几种有效的转基因方法 转基因生物的筛选与鉴定 基本步骤 1.分离获得目的基因； 2.在体外进行DNA重组，将外源DNA连接到能自我复制又带有选择标记的载体上； 3.将重组DNA转移入受体细胞； 4.筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆； 1、目的基因制备和载体系统 目的基因来源：基因组DNA分离、化学合成、PCR扩增、cDNA文库及DNA文库中制得。 载体：质粒、λ噬菌体 、柯氏质粒 、YAC载体 等 工具酶：限制性内切酶、连接酶、DNA聚合酶 等 1.目的基因的分离 （1）已知基因的获得 ①化学合成法 ②PCR扩增 （2）未知基因的获得 ①构建基因组文库，筛选目的基因 ②构建cDNA文库，筛选目的基因 ③mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 ④差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因 …… 2.良好载体需要满足的条件 1、必须有自身的复制子； 2、载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位点，即多克隆位点，以供外源DNA的插入； 3、载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子； 4、载体分子必须有足够的容量； 5、可通过特定的方法导入细胞； 6、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、增强子、加尾信号等DNA调控元件。 质粒载体 质粒（plasmid）是能自我复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体外的方式存在。 每个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列，它能帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。 高拷贝数的质粒，在宿主细胞中能达10～100个拷贝；低拷贝数的质粒，在宿主细胞中只有1－4个拷贝。 质粒要成为克隆载体，就必须进行遗传改造，使之成为一个具有单一的限制性内切酶识别位点、多个选择性标记。 质粒载体pBR322 1.大小为4361bp，含有抗氨苄青霉素和抗四环素这样两个抗生素抗性基因 2.在四环素抗性基因内部，还具有BamH I、Hind Ⅲ和Sal I 三个识别位点。 3.Pst I识别位点在氨苄青霉素抗性基因 4.pBR322带有一个复制起点，可以保证质粒只在大肠杆菌里进行复制功能。 pUC19质粒 长2686bp，带有pBR322的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子β－半乳糖苷酶基因（lac Z’）的调节片段，一个调节lac Z’基因表达的阻碍蛋白的基因lac I，还有多个单克隆位点。 pUC19的筛选将转化细胞涂布到含有氨苄青霉素、IPTG和X－gal的固体培养基上，那些带有自身环化质粒的细胞由于能够形成具活性的β－半乳糖苷酶，所以菌落是蓝色，如果插入有目的DNA片段，无法形成杂合β－半乳糖苷酶，菌落时白色的。 λ噬菌体 λ噬菌体染色体是长约49kb的双链DNA，该DNA的两个5’末端都是由12个bp组成的单链互补粘性末端，当λ噬菌体DNA进入宿主细胞后，这两个粘性末端互相结合，在连接酶作用下封闭成环 在λ噬菌体基因组中位于左边的基因（A-J）编码噬菌体头部和尾部的蛋白质，中间的基因（J-N）与重组和生长过程有关，但与裂解生长过程无关，因此对裂解生长过程来说，中间区的DNA是非必需的，可以被缺失或置换，因此可以在这个区域克隆外源DNA，右边的基因涉及λ基因的表达、调节、DNA合成晚期功能调节以及宿主细胞裂解等。 λ噬菌体载体 分类：插入型载体和置换型载体。 插入型载体：具有单一的酶切位点，可供外源DNA的插入。 置换型载体：有成对的酶切位点，在两个酶切位点之间的DNA片段，可被外源DNA片段置换。 λ噬菌体载体可以克隆较大DNA片段，最大长度约为24kb，只需将λ噬菌体DNA、尾巴和纯化的空的头，混在一起就可以在体外产生具有侵染性的噬菌体颗粒。 柯氏质粒 Cosmid 柯氏质粒可克隆携带40kb大小的DNA片段，并在大肠杆菌中复制保存，综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优点。 柯氏质粒上带有多个单克隆位（RE2），两个cos位点，DNA复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个cos位点之间还有一个限制性内切酶位点（RE1）。 2、遗