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聚磷菌鉴定技术探究进展 　　摘要聚磷菌是完成生物除磷的主要功能菌，鉴定其在活性污泥中的比例对研究生物除磷技术有重大意义。本文综述了聚磷菌鉴定技术的研究进展，对传统菌种分离技术和荧光原位杂交技术在除磷方面的应用做了总结，分析了各种方法的优缺点，以期对相关问题的研究人员有所帮助。 关键词聚磷菌鉴定技术荧光原位杂交技术 中图分类号：TQ649 文献标识码：A 磷是造成富营养化的主要因素，控制水环境中磷的注入尤为重要。生物除磷工艺经济有效且无二次污染，形成的污泥沉降性能好且肥效高，在污水除磷方面得到广泛地应用[1, 2]。生物除磷主要通过生物同化作用除磷和强化生物除磷(EBPR)两种方式来完成。前者利用悬浮生长的微生物直接吸收磷。活性污泥中有一类微生物，可以在好氧条件下逆浓度梯度过量吸收磷酸盐合成多聚磷酸盐贮存在胞内，研究者称这类功能细菌为聚磷菌(PAOs)[3]。EBPR是利用活性污泥中的PAOs厌氧释磷和好氧吸磷的特性，最终通过排放含有大量聚磷颗粒的污泥达到从废水中去除磷的目的。 对于活性污泥中的PAOs进行鉴定，并研究其生理特性，对推动生物除磷技术的进步[]有重大意义。本文综述了PAOs鉴定技术的研究进展，并重点分析了传统菌种分离技术和荧光原位杂交技术的优缺点，希望对生物除磷研究领域的初学者有所帮助。 1分离纯化技术 分离纯化技术是最早被采用的研究方法，但这种方法得到的纯培养菌往往缺少PAOs的关键特征[4]即在厌氧条件下，吸收乙酸盐转化为PHAs储存，同时水解储存的聚磷酸盐，释放出正磷酸盐。 长久以来，对于微生物群落结构的研究方法一直是建立在分离和培养方法上。然而，据统计自然界中不到1%的细菌可以被培养。PAOs是由不同微生物群落组成的，其群落结构受工艺和控制条件的影响很大。在纯培养过程中，改变了它们的生长条件。因此分离出的菌是否存在于实际的除磷系统中，以及其是否具有PAOs的生化特性都有不确定性。而且这种方法费时费力，往往不能准确的反映出混合菌群的组成和多样性。分子生物学研究方法在环境微生物领域得到越来越多的应用，以高度灵敏操作简单为特征的荧光原位杂(FISH)技术在PAOs的鉴定方面显示出巨大的优越性，受到了广泛的关注和应用。 2荧光原位杂交技术 原位杂交(ISH)技术能够克服传统方法上微生物分离培养的困难，同时避免了其它分子生物学方法的复杂过程，能够快速准确地反映出微生物群落组成和结构，已成为了研究微生物群落的重要技术。 2.1原位杂交技术的原理 原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测RNA或DNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。ISH技术克服了以往除磷菌难于用常规方法培养研究的困难，且操作安全，实验周期短，特别是可以同时分析一种以上的探针，从而被广泛应用，成为了微生物学研究的有力工具。 2.2荧光原位杂交技术在除磷方面的应用 FISH技术是在原有放射性ISH技术的基础上发展起来的，是一种重要的非放射性ISH技术。近年来，强化生物除磷的研究重点已经转移到对活性污泥内部微生物种类及其特性的研究上来。余利岩等曾提到，污泥中99%的细菌无法独立培养。而FISH技术以分子生态学研究为主要手段，可以直接鉴定污泥微生物种类，还可以很好地对某种微生物进行定量分析。在对PAOs的量化研究中，FISH技术被广泛应用。 Kawaharasaki等采用DAPI荧光染料和α-，β-和γ-Proteobacteria特异性低聚核苷酸探针，对厌氧/好氧序批式EBPR反应器中活性污泥聚磷酸盐积累菌(PAO)进行了识别。结果表明，所采用的FISH技术是现场识别PAO细菌的有效方法。Bond等应用FISH技术比较鉴定了恶化的EBPR反应器活性污泥和恢复的反应器活性污泥中的主导微生物的丰度，并结合DGGE技术研究证实了Acinetobacter并不是唯一的PAOs，且在全面的污水厂中含量也不高。Mamoru对除磷工艺的FISH研究中，发现无论好氧或厌氧区的活性污泥中都存在着大量丰富的除磷微生物，其中常见类群为BetProteobacteria类的Actinpbacteria 、GPB、HGC和Epbrl5等。与非EBPR相比，Bond等应用FISH技术发现，EBPR系统中存在一种微生物经鉴定为Rholocyclus，也是生物除磷的优势种群。后来，Johwan Ann等结合FISH和PCR-DGGE技术对反应器中的活性污泥微生物群落结构与分布进行了研究，经考察得出Rholocyclus spp.的菌落形态呈密集状。M.O