mTOR特异性siRNA重组表达载体的构建及鉴定.pdfVIP

堕 墅 堂2Q!生12旦笙 鲞笙 塑 墨瞍 塑塑旦nd 盟 丛 !!曼，旦 ：至Q V(!．： ! · 52l· · 论 著 · mTOR特异性 siRNA重组表达载体的构建及鉴定 张才成 ，陈静 ，陈唐勇 ，章登珊 t，郑晓丰 ，李俊明 (1、南 昌大学第一附属医院检验科 ，江西 南 昌330006；2、江西护理职业技术学院，江西 南 昌3300O61 摘要： 目的 构建mTORsiRNA重组表达载体，为探讨 RNA干扰技术抑制巨噬细胞mTOR基因的相关研究奠定基础。 方法 设计具有短发夹结构的DNA序列，经退火成互补双链，再克隆至载体 pGPU6G／FPN／e0中构建重组表达载体，转化 DH5c~菌株，提取质粒行酶切鉴定后，并进行序列测定。再转染人巨噬细胞 RAW264．7，进行荧光摄像和阳性克隆筛选。 Westernblot方法检测巨噬细胞 mTOR蛋 白表达 结果 DNA测序结果及 PCR鉴定证实成功构建小 鼠mTORsiRNA重组 表达载体。Westernblot结果显示转染该重组载体的巨噬细胞 roTOR蛋白表达下降约 4l％。结论 mTOR靶向RNA干扰重组 表达载体构建成功，可以进行稳定筛选 ，该载体对巨噬细胞 mTOR蛋 白表达有抑制作用 。 关键词：mTOR；RNA干扰：重组表达载体 中图分类号：Q522，Q344+．13 文献标识码 ：A 文章编号 ：1674—1129(2013)06—0521—03 DOI：10。3969~．issn．1674-1129．2013．06．003 Constructionand identificationofmTOR specificsiRNA recombinantexpressionvector ZHANG Caicheng,CHEN Jing, CHENTangyong,eta1．ClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,NanchangUniversity，Nanchang330006Chin~ Abstract：ObjectiveToconstructmTORspecificsiRNArecombinantexpressionvectorandprovide~undationtoinhibit macrophagemTOR genebyintenferenc．M ethodsShoa hairpinDNA sequencewasannealedtoform doublechain，thencloned intovectorpGPU6／GFP／Neotoconstructtherecombinantexpressionvector,andthentransfomr edintoDH5ctstrain．Plasmidwas identifiedbyrestrictionenzymedigestionandsequencing，andtransfectedintomacrophageRAW264．7．Fluorescenceimagingand positivecloneswerescreenedafterplasmidtransfection．ExpressionofmTOR proteininmacrophagewasdetectedbywestern blot method．ResultsDNA sequencingandPCR analysisconfirmedthatmicemTOR siRNA recombinantexpressionvectorwascon— strnctedsuccessfully．WesternblotresultsshowedthattheexpressionofmTOR proteininmacrophagethatbetransfectedwiththe recombinantvectordecreasedby41％．ConclusionRNA interferencetargetingmTOR recombinantexpressionvectorwasSuccess— fullyconstructed．andcouldbestabilizedfilter．ThevectorhadinhibitoryeffectonmT0R expressioni