根癌农杆菌介导外源基因转化番茄体系优化.pdfVIP

· 生物技术 · 北方 园艺2010(18)：142～144 根癌农杆菌介导外源基因转化番茄体系优化 潘 永 明 (牡丹江师范学院，黑龙江 牡丹江 157012) 摘 要：为建立优化的番茄外源基因转化体 系，提高番茄的外源基 因转化率，以番茄叶盘预 培养时间和农杆菌与番茄叶盘的共培养温度、共培养时间为试验要素，摸索相对适宜的预培养及 共培养的时间和温度范围，其余操作按常规步骤进行。结果表明：农杆菌与番茄叶盘的预培养适 宜时间为27℃下 32～48h；农杆菌与番茄叶盘的共培养的最适宜条件是：22～24℃下暗培养 48h。 关键词 ：番茄；根癌农杆菌；体系优化 中图分类号：S641．2 文献标识码：A 文章编号：1001--0009(2010)18一O142—03 番茄以其营养丰富、风味独特而成为全世界栽培最 外分光光度仪、美国BECKMAN高速冷冻离心机、无菌 为普遍的果菜之一。番茄栽培过程中常因病虫害的发 操作台、水浴锅、天平、电泳仪、培养箱等。 生影响果实品质和产量．其中番茄病毒病是番茄的主要 1．3 试验方法 病害之一，发生普遍、危害严重。我国南北各番茄产区 试验针对根癌农杆菌介导的基因转化过程中，番茄 均有发病 ，其发病率轻者为 30 、重病 区高达 70 ～ 叶盘预培养时间和农杆菌与番茄叶盘的共培养温度、时 100 ，严重时可使整个地区失收_] 。防治番茄病毒病 间为试验要素。按每 1C 1个梯度，从21～24℃分别设 目前 尚无有效的药剂 ，主要措施是通过培育抗病品 计 4个共培养温度，每个共培养温度下交叉设计 1～4d 种。传统育种在番茄抗病毒病方面效果往往周期较长， 4个共培养时间；同时外植体预培养时间按 4h为 1个 效果不显著。生物技术的应用特别是基因工程在番茄 梯度从O～56h分别设计 15个处理。其余条件按常规 抗病毒病育种中得到了广泛应用，取得了显著成绩。根 操作程序处理。即：农杆菌浸泡叶盘时间按5min计 ，诱 癌农杆菌介导的基因转化系统是 目前研究最多、理论机 导愈伤组织及芽分化的培养基为 MS固体培养基。卡 理最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。与其它基 那霉素培养基作为筛选转化芽的选择培养基。初期为 因转化体系相 比，具有很多突出的优点 。由于品种 50rag／I的继代培养加大选择压力到100mg／I，目的在 问对转化体系的自身差异，故在转化之前首先进行针对 于筛选掉非转化的细胞愈伤组织产生的分化芽。 性的转化试验，从中筛选最优化体系是必要的。该研究 1．3．1 番茄外植体预培养条件优化 番茄外植体预培 以番茄叶盘预培养时间和农杆菌与番茄叶盘的共培养 养：按预培养试验设计的0～56h内的 15个时间梯度， 温度、共培养时间等差异较显著的转化条件为试验要 每过4h取无菌番茄幼苗叶片，剪成四周有伤 口的叶盘， 素，其余转化条件按常规步骤进行。摸索相对适宜的预 正面朝上摆在有 MS固体培养基 (含 NAA0．1mg／I+ 培养及共培养的时间和温度范围。 BA 1．0mg／L)的培养皿上，每次做 2盘培养皿，每皿 5 1 材料与方法 片番茄叶盘，放入培养室内27C光照预培养，共 30盘培 1．1 试验材料 养皿。番茄转化：含CMV-cp基因的工程菌LBA4404活 番茄种子：牡丹江市售；含 CMV-cp基因的载体农 化后，菌液 O ㈨一0．3～0．7时，用 1MS培养液替换 杆菌 LBA4