《中药制药分离技术结题报告》硅胶层析实验.pptVIP

THANKS * 硅胶层析实验 第一小组 2016.6.27 1号：顾 月 2号：范智毅 3号：张子杨 4号：仝瑶 5号：陈铭佳 实验设计 实验目的 实验内容 实验结果 实验目的 1 了解银杏叶提取物中有效药物成分 2 了解硅胶吸附原理 3 研究硅胶柱层析分离规律及实验验证 4 研究不同类型洗脱剂对硅胶柱层析分离的影响 实验目的 1.总黄酮类：槲皮素、山奈素、异鼠李素 2.萜内酯类：白果内酯、银杏内酯A，银杏内酯B、银杏内酯C 3.少量银杏酚酸、氨基酸、生物碱类等 本次实验主要研究： 硅胶对总黄酮类以及萜内酯类的吸附分离 硅胶层析 总黄酮 萜内酯类 银杏叶提取物主要有效成分 实验内容 银杏叶提取物主要有效成分 实验内容 硅胶吸附原理 硅胶是多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅氧烷是疏水集团，硅醇基是使硅胶具有吸附力的活性基团。它能与极性化合物或不饱和化合物形成氢键或发生其他的相互作用，硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量有关。被分离组分由于极性和不饱和程度不同，和硅醇基互相作用的程度不同。 硅胶除氢键吸附外，因为有硅氧键、硅醇基，且其分子骨架主要由硅烷基构成，有明显的取向力及色散力，所以可以吸附不能形成氢键的低极性化合物。 实验内容 仪器与试剂 1.仪器：硅胶制备柱、量筒（100ml、200ml、500ml）、烧杯（50ml、100ml、200ml、500ml）、玻璃棒、滴管、小漏斗、10ml容量瓶、高效液相色谱仪、移液管、洗耳球、脱脂棉。 2.试剂：银杏叶提取物，100目硅胶、银杏提取物、白果新酸（萜内酯）对照品、芦丁（黄酮苷）对照品、乙醇（50%、95%）、乙酸乙酯、甲醇（色谱纯）、四氢呋喃、磷酸、石油醚、正丙醇。 实验内容 干法装柱 1、塞棉花。取一小块棉花铺平，弄成和层析柱直径一样的圆形，放入层析柱底部，用一根较长的棒压着棉花，关闭层析柱活塞，加一点洗脱液浸润棉花，赶走棉花中的空气。 2、倒硅胶。硅胶通过漏斗装入柱内，中间不间断，形成一道细流。 3、敲柱子。然后再用洗耳球轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再用淋洗剂走柱子。 实验内容 干法装柱 实验内容 上样与洗脱 1.上样：采用干上样，取5.0g银杏提取物，加入50g硅胶，用95%乙醇溶解，放烘箱中烘干，取15克，上样，不得扰动柱床表面。 2.洗脱：用不同洗脱剂先后洗脱，洗脱先后顺序： ①乙酸乙酯 ②50%乙醇 ③95%乙醇 打开下端活塞，用足量洗脱液进行洗脱，在洗脱过程中，注意随时添加洗脱剂以保持液面的高度恒定，特别注意不可使柱面暴露于空气中。 每200ml留样，每种洗脱剂留8个样，控制流速2-3d/s。 实验内容 对照品及供试品溶液制备 对照品溶液制备： （1）取白果新酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含1 μg的溶液作为对照品溶液。 （2）取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液作为对照品溶液。 供试品溶液制备： 取留样液各1ml,，分别置于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，离心，即得。（乙酸乙酯洗脱液需水浴蒸干后用甲醇溶解并定容） 实验内容 色谱条件及测定法 1.总黄酮类：以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇—0.1%甲酸溶液（30:70）为流动相，检测波长为360nm，柱温为45℃，流速：1.0ml/min，测定法为自动进样10μl。 2.萜内酯类：固定相:C18(250mm×4.6mm×5μm);流动相:甲醇:水(28:72)；柱温：35℃；流速：1.0mL/min；检测器：蒸发光散射检测器；温度：45℃；氮气压力：350kPa。 实验结果 类别 峰面积 干法-乙酸乙酯 无 干法-50乙醇2 139566439 干法-50乙醇3干法-50乙醇4 6098106 干法-50乙醇5 2832667 干法-50乙醇6 1667725 干法-50乙醇7 1071354 干法-95乙醇1 423423 干法-95乙醇3 无 黄酮类 实验结果 黄酮类 由实验数据可以看到 （1）乙酸乙酯洗脱液中没有检测出黄酮类化合物，即乙酸乙酯对黄酮类化合物的洗脱能力较弱，而用乙醇洗脱时，能洗脱出较多的黄酮类化合物。推论：不同洗脱剂洗脱，随着洗脱剂极性的增加氢键效应增强，洗脱能力增强，可能的洗脱能力强弱顺序：乙醇＞乙酸乙酯。 （2）50%乙醇洗脱时，检测出的黄酮类化合物峰面积越来越小，推论：随着洗脱剂用量的增加，黄酮类物质含量逐渐下降。 （3）95%乙醇洗脱液中黄酮类化合物含量很少，用95%乙醇洗第三次时，洗脱液中没有检测出黄酮类化合物。推论：95乙醇已将溶液的黄酮类化合物完全洗脱下来。 实验结果 萜内酯类 银杏叶中黄酮苷及苷元类成分