一种新型草鱼呼肠孤病毒人工感染方法.pdfVIP

第 40卷第 6期 水 生 生 物 学 报 Vo1．40．NO．6 2016年 11月 ACTA HYDROB10L0GICA SINICA N OV．，20 16 一 种新型草鱼呼肠孤病毒人工感染方法 褚鹏飞' 何利波 汪 浩 ' 陈 庚 李勇明 黄 容 廖兰杰 朱作言 汪亚平 (1．中国科学院水生生物研究所，淡水生态与生物技术国家重点实验室，武汉430072；2．中国科学院大学，北京 100049) 摘要：研究从患病草鱼中新分离到一株草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus，GCRV)，对其进行了病毒纯化与 电镜观察、基因组RT．PCR分型以及病毒量定量分析等，并在此基础上探索了一种新的病毒人工感染方法。 取病鱼肌 肉组织进行病毒纯化与电镜观察，观察到大量病毒粒子，直径在70—80nm。病毒基因组RT．PCR扩 增结果表 明，该草鱼呼肠孤病毒新分离株属基因型II型GCRV；通过绝对定量的方法，对病毒悬液的浓度进行 了测定，为2．97x10copy／gL。通过灌 胃法，对3个组别的实验鱼分别感染不同浓度的病毒液，同时设置灌 胃 PBS的组别作为对照组 。结果显示，3个实验组死亡率均在80％左右，而对照组仅出现一例死亡个体。实验组 死亡个体体表发黑，腹部、鳍条基部 以及鳃盖处均有明显的出血症状，为草鱼出血病的典型症状 。随机选取 死亡的个体进行RT．PCR检测，均能检测出II型GCRV的条带。以上结果说明，灌 胃法可以作为一种新的方法， 用于草鱼的GCRV人工感染实验。 关键词：草鱼呼肠孤病毒；人工感染；水产养殖；RT—PCR；分型 中图分类号：Q一31 文献标识码：A 文章编号：1000-3207(2016)06—1166—06 草鱼(Ctenopharyngodonidellus)属鲤形 目，鲤 死性，致死率高达85％ 。1978年，中国科学院水生 科，雅罗鱼亚科，草鱼属。作为我国传统水产养殖 生物研究所陈燕桑等经进一步研究确定草鱼出血 品种 “四大家鱼”之一，其养殖成本低廉，养殖范围 病病原为病毒，随后从病鱼体内分离鉴定了该病毒， 广，具有巨大的经济价值。20l4年，全球草鱼产量 并根据病毒的形态和理化特性命名为草鱼呼肠孤 为5．5×10kg，占全球淡水鱼类养殖总量的13％ 。 病毒 加。 2015年 草鱼全基因组序列图谱的绘制完成拉开 了 GCRV作为 国内第一株被分离的水生呼肠孤 草鱼分子育种的序幕 ’。可 以预见，草鱼养殖业 病毒，因其对水产养殖业具有 巨大的危害，所 以一 将会迈向新的阶段。然而多年来，草鱼出血病(Grass 直以来都受到广泛的研究 。然而，GCRV疫苗的 carphemorrhagicdisease)~直是草鱼养殖业 的一大 研制，抗性基因的发掘，优 良抗病 品种的培育等研 绊脚石，给广大养殖户带来了巨大 的损失，同时也 究工作都离不开对实验鱼进行GCRV的人工感染 给草鱼养殖业前景蒙上巨大阴影 。目前，该病 己被 实验。 目前。水产动物常用的病毒人工感染方法有 中国农业部列入二类动物疫病病种名录 。 腹腔注射感染 2J、高渗浸泡感染 、饲料拌喂感染 草鱼出血病病原为草鱼呼肠孤病毒(Grasscapr 等 。这些方法虽然各有优点，但都存在一些局限， reovirus，GCRV)，属水生呼肠孤病毒属的C群，是中 腹腔注射感染容易造成鱼体及脏器创伤从而导致 国分离鉴定并首次完成全基因序列分析的鱼类病 非病毒感染性死亡；高渗浸泡感染的剂量和时间不 毒p 。GCRV病毒具有双层衣壳，含有11个片段 容易控制：饲料拌喂感染需要较长时间的喂食驯 的双链RNA 。GCRV对幼龄的草鱼具有极强的致 化，从而给后续实验数据分析带来