一种优化小鼠成纤维细胞中自噬小体示踪的方法.pdfVIP

第26卷第 1期 中 国组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志 V01．26．No． 1 2017年 2月 CHINESE JOURNAL 0FHISTOCHEM ISTRYAND Y February． 2017 一 种优化小鼠成纤维细胞 中自噬小体示踪的方法 杨侃 ，李晓宁 ，OmaribaGideon，李凯 ，周宇荀 ，肖君华 (东华大学 环境科学与工程学院，学化工与生物工程学院，上海 201620) [摘要] 目的 为了提高对自噬小体示踪的精确度和清晰度，全面展示细胞 自噬相关进程，优化基于绿色荧光蛋白一 微管相关蛋白1轻链 3B (GFP-LC3p)标记物的自噬小体示踪方法。方法 组织块贴壁法原代培养小鼠耳成纤维细胞 ，脂 质体转染过表达GFP．LC3B；GFP．LC331充分表达后给予药物刺激以激活或阻断细胞 自噬通路，然后进行免疫荧光染色。对 染色操作进行优化 ：首先，延长多聚甲醛的固定细胞时间 (从 15min延长至45min)；其次，提高TritonX-100处理时间， 除第一次和最后一次使用PBS润洗，其余每一次使用的PBS都添加0．2％TritonX一100；最后，提升抗体稀释液中BSA和 TritonX．100含量，BSA从3％提升至5％，TritonX一100的含量从0．1％提升至0．2％。结果 拍照后统计 自噬小体发现，新 方法更加准确地标记GFP．LC331指示物 ，自噬激活条件下示踪准确度显著提升 (达4．2倍)；新方法更加清晰地呈现 自噬小 体的形态和胞内分布，将 自噬小体示踪的清晰度显著提升 (达2．5倍)；新方法还能使用不同荧光通道，同时标记其他 自 噬相关基因。结论 本研究提供的一种优化小鼠成纤维细胞中自噬小体示踪的方法将为全面展示细胞 自噬进程、深入了解 细胞 自噬相关机制提供有力的技术支持。 [关键词] 细胞 自噬；绿色荧光蛋白一小鼠微管相关蛋白1轻链 3B；自噬小体示踪；原代培养 [中图分类号]Q2-33 [文献标识码]A DOI：10．16705／j．cnki．1004—1850．2017．o1．012 Optimizationofamethodtotracetheautophagosomesinmousefibroblasts YangKan，LiXiaoning，OmaribaGideon，LiKai，ZhouYuxun ，XiaoJunhua' rCollegeofEnvironmentalScienceandEngineering, CollegeofChemistry,ChemicalEngineeringandBiotechnology, DonghuaUniversity,Shanghai201620，China) [Abstract] ObjectiveToimprovetheaccuracyandclarityofautophagosometracing，fullyrevealtheprocessofautophagy，and optimizetheautophagosometracingmethodbasedon(greenfluorescentprotein—lightchain313ofmicrotubuleassociateprotein1，GFP— LC331)．MethodsMouseearfibroblastswereobtainedfromprimaryadherentcultureoftissueexplants．GFP-LC331wastransfectedby lipofectionandover—expressed．AfterGFP—LC313wasfullyexpressed，rapamycinorchloroquinewasappliedtostimulateorblockthe autophagypathway．Immunofluorescentstainingwasperformedafterwards．Thestainingstrategywasoptimizedasbelow：(1)thetime ofparaformalde