生物工艺学第2章 基因工程工具酶1.ppt

;;;基因工程工具酶及其应用;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口;;一. DNA的连接方法 两种不同的DNA分子可以经过下述的方法之一进行连接,而方法的选用则是根据其两者末端的DNA结构. 1. 直接连结法---该法适用于: 1)??同种限制酶作用不同DNA片段产生的相同粘性末端 重组DNA可用同种酶再切开 2) 不同种限制酶作用不同DNA片段产生的相容性末端 i.重组DNA分子不能再为这两种酶所作用,如:BamHI/BglII ii.重组DNA分子可为其中一种酶所作用,但为另一种酶作用的可能性较小,如MboI/BamHI 3) PCR产物与特定载体的连接 4) 限制酶和其他方式产生的平末端.;2.人工接头连接法 1) 人工接头（linker）的结构 i. 中轴对称互补,可自行退火形成双链.如: 5-CCGGAATTCCGG- 3 3-GGCCTTAAGGCC-5 ii. 至少有一特定的限制酶识别位点 iii. 某种限制酶的一套人工接头可使插入片段与表达载体保持同相.如: 八聚体 d(GGAATTCC) 十聚体 d(CGGAATTCCG) 十二聚体 d(CCGGAATTCCGG) 2) 用途 ??? i. 平整末端的连接(各种结构的DNA末端均可经过修饰变成平整末端) ; ii. 产生新的克隆位点 ??????? iii. 合成匹配接头 3) 连接方法 ??? 人工接头磷酸化 退火形成双链 与目的DNA相连 限制 酶切 两DNA分子相连 4) 适用范围 人工接头连接法适合于那些只有一种DNA片段需加人工接头就可以与另一DNA分子相连的DNA分子.利用人工接头也可使任意两个平端的DNA分子相连.这种直接相连的办法简便,快速,但最后连接起来的DNA可能具有不同的结构.为避免这些结构的产生,可先使一种DNA先加上人工接头后,再与另一种DNA分子相连.;3. 匹配接头连接法 人工接头虽然可连接两个具不同末端的DNA分子,但这些末端在加入人工接头前必须变为平整末端.然而,有时实验不容许使用人工接头或使用人工接头不方便,此时,便可使用匹配接头,它可用于直接连接各种具不同末端的DNA分子: i. 平端 + 突起末端(5’-突起, 3’-突起) ii.粘性末端 (5’-突起 + 5’-突起: EcoRI+HindIII 5’-突起 + 3’-突起: EcoRI+PstI 3’-突起 + 3’-突起: PstI+SacI) 1)??匹配接头的结构特点 i.?? 由两个低聚核苷酸组成 ii. 部分区域可以互补 ??? iii. 退火后的双链低聚核苷酸可以形成两个不同的末端 2)??匹配接头的种类; i.?? 预制匹配接头(连接平端和粘性末端) 人工接头 + 匹配接头 预制匹配接头 ii. 转换匹配接头(连接5’-突起和3’-突起末端) 二匹配接头退火 转换匹配接头 二人工接头 连接酶 双酶切 转换匹配接头 iii. 单链匹配接头(连接5’-突起和3’-突起末端) 4. 同聚物加尾连接法 在两个不同的DNA分子末端各加上一个可互补的同聚物,即AT或GC. 5. 连接方法的选择 方法选择的依据: 1) 两DNA分子的末端结构 2) DNA 分子的限制酶谱 3) 是否需要回收DNA片段;连接方式的选择 载体末端 外源DNA末端 常规连接 脱磷酸化 同聚物 平端连接 补齐,人工接头 结构 结构 载体 加尾 外切酶