第三章基因工程第一节 基因工程工具酶.wangjx.ppt

第一节 基因工程中的工具酶;一、限制性内切酶;（一）、限制修饰系统的种类;（二）、限制性内切酶的定义、命名;（三）、限制酶的特点; ３）?平齐末端 SmaI 5’-CCCGGG-3’ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ 3’-GGG CCC-5’ ４）非互补的粘性末端 ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’ 5’-GGATG(N)9 3’-CCTAC(Ｎ)13-5’ 3’-CCTAC(N)13 ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI AvaI 5’-CPyCGPuG-3’ CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG ; ;5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’ 3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’; 5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘;酶切条件：酶切缓冲液;（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）;（五）、 限制酶的用途;酶切图谱的构建（a）;酶切图谱的构建（b）;二、DNA甲基化酶（一）、 甲基化酶的种类与识别顺序;2.???? II型甲基化酶对限制酶活性的影响 １） 抑制同种限制酶的活性 M.BamHI GGATmCC—BamHI(G?GATCC) M.EcoRI GAmATTC—EcoRI(G?AATTC) ２） 抑制不同种限制酶的活性 a. 顺序完全重叠 如：M. ClaI（ATCGmAT）----TaqI（TCGmA） b. 顺序边界重叠 如：M. BamHI（GGATmCC）----MepI（mCCGG） ３） 抑制不同种限制酶的部分活性 M．TaqI（TCGmA）---HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC 3.???? 甲基化酶的用途 １） 改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成 ２） 在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切;;三、核酸酶（一）、外切酶III（ExoIII）; 3.??外切酶活性特点 1) 反应底物：互补ds-DNA 2) 碱基释放速度：CA-TG 3) 反应产物：5’-单磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，过度反应将导致DNA降解 4.??用途 1)??? 核酸（DNA）标记 2)??? 基因突变----缺失 3)??? DNA序列测定时作顺序缺失 5.??使用注意事项 1)??? 正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度 2)??? 在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区(来自于cDNA加尾);ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口;;1 2 3 4 a b c;（二）、RNase（三）、RNaseH;（四）、 DNase I; Mn++存在时 ;四、聚合酶;3. 用途 1） 除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时） 2） 补齐5’-突起端 3） 合成第二条cDNA 4） 切口移位制备探针 其中用途2) 和3)常用大片段;（二）、 T4 DNA聚合酶;(三) T7 噬菌体DNA聚合酶;（四）、Taq DNA聚合酶;Taq Pol 和PCR ;(五) 不倚赖于模板的DNA聚合酶;(六) 倚赖RNA的DNA聚合酶;(七) 倚赖DNA的RNA聚合酶;(八)不倚赖DNA的RNA聚合酶;五、连接酶;5’-AAGCTT-3’ 5’-AOH PAGCTT-3’ PAGCTT AOH 3’-TTCGAA-5’ 3’-TTCGAP HOA-5’ HOA TTCGAP 退火