2013.11.15基因工程.ppt

基因工程 Genetic Engineering;相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系;一、重组DNA技术相关概念 ;技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　;DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 ;（二）工具酶;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;定义 核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始催化水解3’5’-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸（DNA为dNTP，RNA为NTP）。;限制性内切酶（restriction endonuclease）是DNA操作过程中所使用的基本工具。 特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。 分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;★ 平末端在识别顺序的中心对称轴处切割;★ 3’端粘性末端在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3’末端切割。;5’ G-A-A-T-T-C 3’ 3’ C-T-T-A-A-G 5’;名　　称　　 　识别序列及切割位点;同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同类型的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。;cDNA (complementary DNA) 指经反转录合成的、与RNA (通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。 基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。 ;（四）基因载体;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。;载体的选择标准;;1. 质粒 (plasmid);λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）;;酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）;二、重组DNA技术基本原理; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程;（一）目的基因的获取;* 化学合成法获取目的基因;组织或细胞染色体DNA;限制酶切位点;mRNA ;通过PCR获取目的基因 ;PCR?技术实际上是在模板DNA、引物和4?种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于耐高温DNA?聚合酶的体外酶促合成反应。 PCR?技术的特异性取决于引物和模板DNA?结合的特异性。反应分为三步：1?热变性：在高温条件下，DNA?双链解离形成单链DNA；2?退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3?延伸：在DNA?聚合酶、dNTPs?和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA?链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板。;目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。 ;（三）外源基因与载体的连接;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接;2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端;目的基因;3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出