化学发光Southernblot法检测HBV体外复制及其应用于药物对HBV的抑制分析.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（４）：７８～８２ 化学发光Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＨＢＶ体外复制及其 应用于药物对ＨＢＶ的抑制分析 易学瑞　袁有成　陈文吟　苏　蔚　张　峰　刘振扬　孔祥平 （解放军第四五八医院全军肝病中心　广州　５１０６００） 摘要　目的：建立化学发光Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测细胞内ＨＢＶＤＮＡ的方法，同时检测３种不同靶点抗 乙肝药物的体外作用。方法：用地高辛标记ＨＢＶ探针，优化杂交条件，检测来自ＨｅｐＧ２及 ＨｅｐＧ ２．２．１５ＨＢＶＤＮＡ复制中间体；利用建立的化学发光Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测ＨＢＶＤＮＡ的方法检测经 拉米夫定、Ｂａｙ４１４１０９、Ｇａｌｃｅｒ以不同药物浓度处理的ＨｅｐＧ２．２．１５ＨＢＶＤＮＡ复制中间体的水 α 平。结果：（１）标记的ＨＢＶ探针的检测灵敏度为０．１ｐｇ，杂交系统的检测灵敏度为１ｐｇ，可检测到 ＨｅｐＧ２．２．１５细胞内的ＨＢＶＤＮＡ特异性信号；（２）以该法检测胞内ＨＢＶＤＮＡ可见３种药物都有 明显的抑制作用，其半数有效量（ＩＣ ）分别为１．５３ｍｏｌ／Ｌ、０．４１ｍｏｌ／Ｌ、０．０１ｍｏｌ／Ｌ。结论：胞质 ５０ μ μ μ ＨＢＶＤＮＡ的水平能准确地反映不同靶点抗ＨＢＶ药物的抗病毒效果，建议在观察药物特别是中药 抗病毒研究中采用。 关键词　ＨｅｐＧ２．２．１５细胞　ＨＢＶ复制中间体　Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ　拉米夫定　Ｂａｙ４１４１０９ Ｇａｌｃｅｒ α 中图分类号　Ｑ８１９ 　　自１９８７年Ｓｅｌｌｓ等建立 ＨｅｐＧ２．２．１５细胞株，作为 １　材料与方法 抗ＨＢＶ体外复制模型在药物筛选中得到广泛的应用， 尤其是传统中草药抗乙肝药物研究方面国内有很多报 １．１　主要试剂 道，但大多通过检测ＨｅｐＧ２．２．１５细胞培养上清的乙肝 　　药物：拉米夫定购自葛兰素史克制药有限公司， ［１］ ［２］ Ｂａｙ４１４１０９购 自德 国 Ｂａｙｅｒ公 司， Ｇａｌｃｅｒ购 自 标志物来衡量抗病毒药物的效果 。近来刘茂昌等 α 研究表明细胞内ＨＢＶＤＮＡ与培养上清 ＨＢＶＤＮＡ及 ＡＬＥＸＩＳ公司；地高辛标记及检测试剂盒（ＤＩＧＨｉｇｈ ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ水平无相关性，而体内研究表明肝细胞 ＰｒｉｍｅＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｔａｒｔｅｒＫｉｔＩＩ）购自 内的ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ和总ＨＢＶＤＮＡ比血清ＨＢＶＤＮＡ更 Ｒｏｃｈｅ公司，Ｔ载体购 自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，ＮＰ４０购 自 ［３］ Ｂｉｏｓｈａｒｐ公司，ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅＡ、ＭＴＴ（四甲基偶氮唑 能反映抗病毒的效果 ，尤其是在总ＨＢＶＤＮＡ中占大 ［３～５］ 蓝）购自Ｓｉｇｍａ公司，ＰｒｏｎａｓｅＥ购自Ｍｅｒｋ公司；细胞培 多数的ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ的水平 。由于 ＨｅｐＧ２．２．１５ ［２］ 养液ＤＭＥＭ购自ＧＩＢＣＯ公司，胎牛血清购自杭州四季 细胞是否存在ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ尚有争议 因此作为检测 青生化厂，Ｇ４１８购自ＧＩＢＣＯ公司，ＤＭＳＯ购自Ａｍｒｅｓｃｏ 指标有待商榷，而Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测细胞内ＨＢＶ复制 公司。 体方法重复性好。因此本文在建立高灵敏