山东省零售肉类样品中分离、鉴定携带志贺毒素基因(stx)O157与非O157大肠杆菌.docVIP

山东省零售肉类样品中分离、鉴定携带志贺毒素基因(stx)O157与非O157大肠杆菌 　　【摘要】实验采用DNA探针杂交技术，对购买的53个市售肉类样品进行检测，31个（58%）样品检测出含有stx基因的大肠杆菌，其中牛肉检出率最高（68%）。分离的42株携带stx基因的大肠杆菌，均不是O157。使用O157特异免疫磁珠技术，从8个牛肉样品中分离到携带eae和stx2基因的大肠杆菌O157。 【关键词】产志贺毒素大肠杆菌；O157特异免疫磁珠技术；DNA探针杂交技术 产志贺毒素大肠杆菌（STEC）的自然宿主是牛和其他动物，因此，零售的肉类可能被STEC污染[2]。尽管STEC包含超过200种O：H血清型，但大部分与严重的人类疾病没有关系。肠出血性大肠杆菌（EHEC）属于含编码紧密黏附素的eae基因的STEC，可以引起严重的胃肠道疾病。由EHEC感染的病例部分是由志贺毒素（Stx）引起。O157：H7/-（H7或H阴性）是EHEC中主要的血清型，可是H抗原很难检测，并且检测之前的动力实验可能导致H抗原丢失。因此，STEC中携带eae基因的O157血清型，作为典型的EHEC菌株，引起人们的极大关注。 本次实验研究了购买自山东省零售肉类样品中非O157和O157的分布情况，筛选了携带stx基因的非O157和O157大肠杆菌，检测了stx1、stx2和eae基因，通过RPLA方法确认了产生Stx1和Stx2毒素的能力。Stx2毒素阴性的STEC O157被发现，鉴定这些菌株将为研究携带stx2基因，却缺乏Stx2毒素的机制提供新的信息。 1、材料和方法 1.1菌株 大肠杆菌O157：H7菌株Thai-12，作为不产Stx2毒素的代表性的阴性对照。 1.2肉类样品中含stx基因大肠杆菌的检测 肉类样品购自青岛当地的超市和市场。25g样品加入225mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB），37℃培养6h。取1mL该增菌液接种10mL TSB，42℃培养2h，作为第二次增菌液。取2次增菌液分别接种DHL琼脂和麦康凯琼脂，37℃培养18～24h。 从每个平板选取40～160个疑似大肠杆菌菌落接种至尼龙膜（Hybond-N+），置于含1%NaCl的Luria-Bertani（LB）琼脂，14℃培养18h。尼龙膜置于含0.5M NaOH的溶解液10min，之后用含1.0M Tris-HCl（pH 7.0）的中和液中和1min，重复3次，最后置于含1.0M Tris-HCl（pH 7.0）和1.5M NaCl的变性液10min。将膜置于80℃固定DNA 2h。每个DNA菌落印迹与含地高辛标记的stx1和stx2基因探针进行杂交。 标准的生化试验鉴定为大肠杆菌之后进行stx1和/或stx2基因阳性分离。生化试验包括传统的吲哚试验、甲基红试验、VP试验、柠檬酸盐试验、赖氨酸脱羧酶试验和三糖铁试验。符合上述特性的分离物确定为STEC。 为了定量检测肉中的STEC，25g样品加入225mLTSB，均质1min，运用MPN法检测STEC，按照上述方法鉴别，根据MPN检索表读数。 1.3肉类样品中含stx基因大肠杆菌O157的选择性分离 取1.2中第二次增菌液1mL与包被抗O157抗体的免疫磁珠（Dynabeads）连续搅动反应10min，将免疫磁珠置于CHROMagar O157琼脂培养，紫色的菌落按照下述PCR方法筛选stx1和stx2基因，PCR阳性的按照下述方法确定是否为O157，确定含有O157的按照上述方法确实是否为大肠杆菌。符合上述特性的分离物确定为含stx基因大肠杆菌O157。 1.4STEC的鉴定 运用PCR方法检测STEC中stx1、stx2和eae基因，运用RPLA方法检测Stx1和Stx2毒素，运用凝集实验检测O157抗原，运用脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法检测DNA指纹，这些方法描述如下。 运用PCR方法，检测菌株于5mL LB肉汤37℃振荡（150rpm）培养过夜，培养物煮沸10min，800g离心10min，取上清液检测。使用商业合成的引物检测stx基因，EVT-1和EVT-2检测stx1基因，EVS-1和EVS-2检测stx2基因（TaKaRa Biochemicals）。PCR扩增，按照引物生产商提供的程序，用1.5%的琼脂糖凝胶检测特异的扩增产物。eae基因使用AE19和AE20引物扩增该基因内1，087bp的序列。扩增程序如下：预变性96℃35min，设置35个循环，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环结束后最终72℃延伸7min。 运用RPLA方法检测Stx1和Stx2毒素，检测菌株于酸酵母提取物培养基