人突变型CDK2（F80A）稳定细胞系的建立.pdfVIP

第48卷 第5期 吉林 大 学 学 报 (理 学 版 ) Vo1．48 No．5 2010年9月 JournalofJilinUniversity(ScienceEdition) Sep 2010 人突变型 CDK2(F80A)稳定细胞系的建立 王佳思，金英花 (吉林大学 分子酶学工程教育部重点实验室，长春 130021) 摘要：将 CDK2激酶第80位的Phe突变成Ala，使该激酶特异地利用ATP类似物N。一(2．苯 乙 基)．ATP(PE—ATP)筛选 CDK2激酶的体 内特异性底物．将 pCMV—CDK2(F80A)．myc载体转染 人宫颈癌细胞(HeLa)，经持续G418选择和克隆化获得 6株抗 G418细胞系．Immunoblotting 分析发现，挑选 的6株细胞系中有 4株表达带有myc标签的人突变 CDK2蛋 白质，其 中2株 表达量较高，可以作为筛选CDK2底物的细胞系． 关键词：稳定细胞系；CDK2；突变；细胞凋亡 中图分类号：Q786 文献标志码 ：A 文章编号：1671-5489(2010)05-0871-05 EstablishmentofaHeLaCellLineStablyExpressing HumanMutatedCDK2(F80A) WANGJia—si，JIN Ying-hua (KeyLaboratoryforMolecularEnzymologyEngineeringoftheMin~tryofEducation． JilinUnivenity，Changchun130021，China) Abstract：Mutation(F80A)onCDK2kinaseallowstheselectiveuseofanATPanalogue—N6_(2一phenylethy1)一 ATP (PE—ATP)，whichexhibitshighaffinityf0rthealteredCDK2．UsingmodifiedCDK2anditsATP analogueenablesthedetectionofnovelCDK2substratesincells．ModifiedCDK2(F80A)一mycwascloned intopCMV vector，and transfected intoHeLa cellsbypolyfecttransfection reagent．The cellsexpressing mutantCDK2wereselectedbytheabilityofresistancetoG418．Thestablytransfectedcelllinewasidentified byimmunoblotting．FouroutofthesixmutantsshowedCDK2(F80A)一mycexpression，andtwoofthemgota higherexpressionleve1．ThehigherCDK2(F80A)一mycexpressingcelllinescanbeusedforscreeningCDK2 substratesincells． Keywords：stablecellline；CDK2；mutation；apoptosis 研究表 明，恶性肿瘤 的发生与细胞凋亡关系密切 ，肿瘤细胞是因为凋亡机制的丧失而获得无限增 殖能力的细胞．细胞凋亡是一种主动的、按固有程序进行的细胞死亡．大多数癌细胞 p53基因丢失或 无功能，而有一些癌细胞 中产生过多抗凋亡蛋 白质Bcl一2或 survivin…，这些都是肿瘤细胞避免凋亡的 方式．鉴于肿瘤细胞与细胞凋亡间的密切关系，研究细胞凋亡的机制有助于人们找到攻克癌症的方 法 ．恢复肿瘤细胞的凋亡能力是治疗肿瘤的一种新途径Ⅲ3 ，已发现一些化合物可以诱导肿瘤细胞 凋亡 ．CDK2是细胞周期性蛋白质依赖激酶之一，它与周期蛋白质 CyclinA相结合在细胞周期 s期 发挥作用，同时参与细胞凋亡的调控过程