优化的绿色荧光蛋白在超嗜热嗜酸古菌冰岛硫化叶菌中的-微生物学报.PDFVIP

微生物学报 A cta Microbiologica Sinica 2017, 57(9): 1362-1372 /actamicrocn DOI: 10.13343/ki.wsxb Biochemistry and Enzymology 生化和酶学 优化的绿色荧光蛋白在超嗜热嗜酸古菌冰岛硫化叶菌中的表达 与应用 黄奇洪，马家兴，倪金凤，申玉龙* 山东大学微生物技术国家重点实验室，山东 济南 250100 摘要：【目的】开发可用于在极端嗜热嗜酸模式泉古菌冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus) 中进行高效表 达的 eCGP123 (enhanced consensus green protein variant 123)荧光蛋白，并用作 S. islandicus 的细胞内蛋 白定位工具。【方法】绿色荧光蛋白突变体 eCGP123 具有极高的热稳定性、耐酸性和可逆的荧光特性等。 本研究主要对 eCGP123 的基因根据 S. islandicus 密码子偏好性进行优化与合成，在大肠杆菌(Escherichia coli) 中表达并研究其蛋白性质；通过在 eCGP123 的 C 末端分别融合具有不同细胞内定位的蛋白(包括 E. coli 来源的 FtsZ 和 S. islandicus 来源的 UpsE 、PCNA1 和 SiRe_1200 等) ，构建 eCGP123 及其融合蛋 白的表达菌株，用激光共聚焦显微镜分析 eCGP123 及其融合蛋白在 E. coli 和 S. islandicus 活细胞中的 亚细胞定位。【结果】我们确认了在E. coli 中表达并纯化密码子优化后的 eCGP123 具有与野生型绿色荧 光蛋白相同的吸光值和较高的热稳定性。细胞学分析显示细胞分裂相关蛋白 FtsZ 和 SiRe_1200 分别主 要定位于 E. coli 和 S. islandicus 分裂细胞的中间；鞭毛组分蛋白 UpsE 呈点状均匀分布，可能定位于细 胞膜上；DNA 复制滑动夹亚基 PCNA1 呈区域性点状分布，暗示了 DNA 复制区域的位置。蛋白的亚细 胞定位与预期结果基本吻合。【结论】绿色荧光蛋白eCGP123 可以作为报告蛋白，应用于 S. islandicus 细胞的蛋白定位分析中，可作为该模式菌株中功能基因研究的重要工具，但需要进一步优化条件。 关键词：绿色荧光蛋白，eCGP123 ，密码子优化，冰岛硫化叶菌，亚细胞定位 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein ，GFP) 在还是与其他蛋白质融合都具有自发荧光的特 最早由 Shimomura 等于 1962 年在研究维多利亚多 性，而且基本上不影响融合蛋白的结构和功能以 管水母(Aequorea victoria) 中冷光蛋白 aequorin 时 及细胞的正常生长。GFP 的分子量小，gfp 基因序 所发现[1] ，它是一种酸性、呈球状的可溶性生物发 列短，目前已经广泛应用于真核生物和原核生物 光蛋白，在紫外光或蓝光激发下，无论是单独存 的基因表达标记、蛋白质的运输和定位、蛋白质 基金项目：国家自然科学基金 ；中国博士后科学基金(11200077311030) *通信作者。Tel/Fax ：+86-531；E-mail ：yulgshen@ 收稿日期：2017-05-08 ；修回日期：2017-06-13 ；网络出版日期：2017-07-05 黄奇洪等 | 微生物学报, 2017, 57(9) 1363 的相互作用、蛋白质构象变化以及生物传感器等 1 材料和方法 研究领域。 1.1 菌株、质粒与生化试剂 由于野生型 GFP 及其大多数突变体的蛋白合 成和折叠速度较慢，荧光强度受表达温度和酸碱 E. coli DH5α与 E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL