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第十四章 酶免疫技术;第二节　酶免疫技术要点 一、酶和酶作用底物 二、酶标记抗体或抗原 三、固相载体 第三节　酶联免疫吸附试验 一、基本原理 二、方法类型及反应原理 第四节 酶免技术应用;第一节 酶免疫技术原理与分类;标记免疫技术=;标记免疫技术 ;放射免疫技术;核心试剂: 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性;免疫技术： Ag +Ab → AgAb 酶标记的免疫技术： Ag*+Ab → Ag*Ab 标记物的作用有二： 一是便于观察反应结果， 二是提高测定的敏感性 ;特点： 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便。;三、酶免疫技术分类 ;;用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 ;最具代表性的两种技术;EMIT示意图;CEDIA示意图;分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免疫测定;第二节　ELISA的技术要点 ;基本原理;三个核心试剂 ;ELISA试剂盒组分;标记酶的要求： 纯度高、活性高 性质稳定 标记后不影响抗原或抗体的活性，也不降低酶的活性 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 酶的反应产物稳定，检测简便、快速 酶的底物易于配制保存，酶及底物安全、易得、价廉 ;辣根过氧化物酶（HRP） ; 碱性磷酸酶（AP） ;底物选择： 1.底物应该是无色，经酶催化后有明显颜色变化； 2.所显色泽易于洗脱； 3.显色后的产物要稳定，定量检测时所产生的有色物质应是可溶的； 4.价廉、易得、无毒。 ;HRP的底物 ;HRP的常见底物 ;OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。;AP的 底物 ;酶免疫技术的核心组成部分 ;（一）抗原或抗体;结合剂要求： 1.不影响酶及抗体或抗原活性； 2.不产生干扰物质； 3.结合效率要高； 4.不出现非特异性反应； 5.易得、价廉。;制备方法要求;制备方法;戊二醛交联法;⑴ 一步法： 将2～5mg 纯抗体与5mgHRP 混合于0.1mol/L pH 6.8 的磷酸盐缓冲液1ml 中，4℃下用同上缓冲液透析平衡。磁力搅拌下加入1%戊二醛0.05ml，在室温下放置2h，在4℃下用0.05mol/L pH 8.0 Tris 缓冲液透析平衡，即可。 ⑵ 二步法： 第一步将过量的戊二醛与酶反应，使酶仅与戊二醛结合；第二步是除去多余的戊二醛分子，加入免疫球蛋白，使球蛋白上的氨基与已结合酶的戊二醛分子上的另一活性基团结合，形成一分子酶和一分子免疫球蛋白结合物。;纯化及鉴定;固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法 ;要求 ;;将抗原或抗体结合于固相载体 一般ELISA包被用的缓冲液都是偏碱性的碳酸盐缓冲液（pH9.6)，目的就是要让被包被的蛋白质暴露较多的阴性集团，更稳定的吸附到板子上。 ;用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附;洗涤液与稀释液;终止液 ;四、固相酶免疫测定仪（酶标仪）;;;;;;;;第三节　酶联免疫吸附试验 　;;固相的抗原或抗体 ;双抗体夹心法 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等;;竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）;洗涤;;;;双抗原夹心法 原理：类似双抗体夹心法 操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体;竞争法 原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测 ;捕获法 应用： 病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体;捕获法 ;;第四节 酶免疫测定的应用;均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体