免疫组织化学染色技术课件.pptVIP

武汉大学病理教研室 4.避免人为造成的非特异性染色 切片的折叠、刀痕，色素沉着，组织细胞坏死。 坏死组织着色：AE1/AE3 嗜酸性粒细胞中细胞色素显色 吞噬细胞内 含铁血黄素 * * 免疫组织化学实验技术 武汉大学病理系 杨飞 免疫组织化学技术的定义 免疫组织化学技术(Immunohistochemistry, IHC)是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内的抗原（或抗体）的分布进行定位、定性、定量检测，经过组织化学呈色反应在组织原位显示抗原（或抗体），如各种蛋白质、多肽、磷脂和多糖等成分的一门新技术。 免疫组织化学的应用 IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理，广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞周期和信号转导的研究等。 实验名称 链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法 (Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法) 检测胃癌组织CK／Vimentin的蛋白表达 S-P法原理示意图 过氧化物酶 链酶亲和素 生物素 生物素化二抗 特异性一抗 待测抗原 具体步骤如下： 　1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 　2．所有组织均采用微波修复抗原； 　3．室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 　4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒孵育 10min； 　5．0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 　6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育 10min； 　7．甩去多余血清，分别滴加２种抗体，4℃湿盒孵育 过夜，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 　8．滴加生物素标记的二抗（试剂C），37℃湿盒孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 　9．滴加链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂D），37℃湿盒孵育 15min， 0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min ； 　10．每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（DAB）显色液，光镜下控制反应时间（约为1-5min），自来水充分冲洗，苏木素复染； 　11．常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析； 　12．阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采用PBS取代第一抗体，其余步骤相同。 实验流程中的注意事项 内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间 检测及显色系统 复染 染色前处理 －取材、脱水、浸蜡 组织及时固定 固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛 常规下固定8-24小时 取材厚度：2mm 染色前处理 －预防脱片 常选用多聚耐氨酸（poly-L-lysine） 注意：1）应严格控制使用次数 2）玻片洁净度 染色前处理 －包埋与切片 包埋：选择低熔点石蜡，温度不超过62℃ 切片：厚度 3-4μm 烤片：温度60℃，时间1小时；或60℃2小时（迈新）；或60℃过夜 染色前处理 －切片保存 切片不宜长时间在常温下保存 染色前处理 －脱腊 原则：免疫组化的脱蜡试剂应与常规HE 脱蜡分开 实验操作中的应用 抗原修复 实验操作中的注意事项 抗原修复 影响染色结果的最关键因素 抗原修复方法分类 1）酶消化法 2）加热法（高压法?水煮法?微波法） 抗原修复液的选择 1）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.2-7.4） 2）Tris（PH 7-8） 3） EDTA（PH 8.0） 内源性过氧化物酶的灭活 存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、 单核细胞、肝细胞及肾细胞 消除方法：3% H2O2 浸泡10分钟 血清封闭 目的：减少非特异性着色