动物病毒学实验技术课件.ppt

6、犊牛血清，其含10多种氨基酸、激素、无机盐类及一些未知成分。不加血清的营养液，细胞不能贴壁，且生长不良。使用前56℃灭活30min，加入的量因细胞种类不同而异，5-10%。 7、抗生素，①青、链霉素，配制成1万单位或1万μg/ml，使用时在营养液中加入1%。②庆大、卡那霉素，广谱抗菌素，抗霉形体且稳定，能耐高压灭菌，营养液浓度50-100 μg/ml。③制霉菌素、两性霉素，配制成1000 μg/ml-20℃保存，使用剂量为5-10 μg/ml，视细胞耐受程度调节。 应用胚胎或幼小动物的组织制备培养，因其分裂旺盛，易生长。各种动物的大多数组织都能在体外培养，最常用的有肾、睾丸、肺、皮肤等。 本试验以鸡胚为例： 1、取10-11日龄鸡胚，气室部消毒，用无菌镊击破蛋壳，除去卵壳、卵膜； 2、将鸡胚移入无菌平皿中，用无菌剪、镊去头、脚、翅、内脏、眼睛，用Hank,s也洗2次，移入三角瓶中，剪成1-2mm2小块用Hank,s洗3次。 四、原代细胞培养 3、按3-5倍加入胰酶，于37℃作用30min，每10min摇一次，静置后弃去胰酶。洗2次加入含血清的营养液或乳汉液，吹打数次。 4、用2层或4层纱布过滤于离心管中，800转/分离心10分钟，取沉淀。 5、按1：200-250加入营养液分装培养瓶或96孔板，于37 ℃静置培养。 五、传代细胞培养 由于遗传突变或在理化学物质的作用下，组织细胞中有时出现恶性变细胞，即癌变细胞。这种癌变细胞具有很高的生长和增殖势能，而且几乎可以无限传代。固称传代细胞系。其染色体已经发生改变，不再是二倍体细胞，故称异倍体细胞。有人体或动物体取得肿瘤组织进行培养，比较容易获得传代细胞系。 传代细胞的传代，将长满单层的细胞用消化液洗3次，消化细胞并使其从瓶壁上脱落下来，敲打细胞培养瓶，使细胞分散，加入2-3倍的营养液，分装细胞培养瓶，静置培养。待长成单层待用。 实验三、病毒的接种及检查 不同病毒接种于细胞的时间不同①待细胞生长成单层后接种病毒；②细胞分装培养12h后接种病毒；③病毒与细胞同步接种培养。 1、将病料制成1：10匀浆，加入双抗，3000转/分，离心30分钟或15000转/分离心5-10分钟，取上清待接种。 2、取不同生长时期的细胞，弃去细胞培养液，按1：10接种病毒材料37℃吸附1/2-2h，使病毒吸附于细胞膜上。 3、弃去病毒液，加入维持液，于37℃静置培养。 4、逐日在显微镜下检查CPE，或进行其他试验。接种病毒2天后，如维持液混浊，说明有细菌污染，弃去。 实验四、空斑形成技术 1952年创立该试验方法，将10倍梯度稀释的病毒样本分别接种于单层细胞，而后在细胞上覆盖一层含营养液的琼脂，以防止游离病毒通过营养液扩散，但病毒可在细胞间传递。经过一段时间培养，进行染色感染病毒的细胞会形成一个近似圆形的斑点，类似固体培养基上的菌落，称为空斑或蚀斑。 空斑是细胞病变的一种特殊表现形式。一个空斑可能有一个以上病毒颗粒感染所致，因此可将获得的单个空斑制成悬液，梯度稀释后再作空斑，最终可以获得只含有一个病毒颗粒及子代的空斑，这就是病毒克隆。 1、测定病毒液中病毒的含量（PFU计）。 2、可以用来测定某病毒的特异性抗体及抗体效价。如：新城疫病毒稀释10-6，每毫升病毒液含100个PFU，即稀释液0.1ml含10个PFU，取培养好的细胞5瓶分别接种0.1ml的病毒稀释液，其中4瓶加入不同稀释倍数的血清，根据空斑形成的多少测定出抗体的有无及抗体的效价。 3、可以获得病毒的纯培养物。 空斑技术的利用可以达到的目的： 4、不同病毒形成的空斑在大小、形态（规则的圆形、欠规则的圆形、完全透明或不完全透明）、形成时间等可以有所不同，该特点有助于识别病毒，并可以此研究病毒的遗传变异。 1、将细胞培养于扁瓶或平皿中，使其长成密集的单层，不能有空隙，吸去生长液，洗2次 2、病毒用Hank,s液，做10倍连续稀释，每个稀释度接种2个培养瓶； 3、37℃吸附60min，每15min转动一次； 检查空斑形成的基本过程： 4、加入融化冷却至45℃的营养琼脂覆盖单层①2×营养液﹢2%琼脂混均（8ml）加在细胞的对面，翻转，37℃培养，根据接种病毒的不同，决定加入第二层的时间（48-72h 2×营养液﹢2%琼脂﹢1：1000中性红，100μg/ml混均7ml。加入的二层后继续培养，肉眼观察，空斑淡白色、背景淡红色。② 2×营养液﹢2%琼脂﹢1：1000中型红，100μg/ml混均，将其加入细胞的对面翻转避光培养。逐日观察。 1、琼脂的质量是空斑技术的关键，要使用高级琼脂或琼脂糖； 2、琼脂融化后放50℃