同位素亲和标签技术.pptVIP

目录 一、蛋白组学研究技术 二、ICAT的发展 三、ICAT原理 四、ICAT的优点与缺点 五、ICAT的改进——VICAT 一、蛋白组学研究技术 蛋白质组学（Proteomics）：细胞的整个蛋白质组成或蛋白质系统的研究。 相对于基因组学，蛋白质组学旨在认识细胞内全部表达蛋白，包括数目、水平和表达蛋白的更新，它们的序列和一切转译后对序列的修饰，以及蛋白与蛋白、蛋白与其它分子之间在细胞内、细胞膜和细胞外的相互作用。蛋白组学分析方法包括分离和提纯蛋白；测序部分或完整序列；识别功能和与其它分子之间的相互作用。蛋白组数据和基因组数据相结合可以帮助人们评估这个学科中出现的新的潜在靶子。 定量蛋白质组学的目的是对复杂的混合体系中所有的蛋白质进行鉴定，并对蛋白质的量及量的变化进行准确的测定，是当前系统生物科学研究的重要内容。 蛋白质组学研究的主要技术有：激光捕捉显微解剖法、双向凝胶电泳、同位素亲和标签技术、蛋白质芯片技术、色谱技术、质谱技术等。 二、ICAT的发展 同位素亲和标签技术（isotopecoded affinity tag,ICAT）最先由Steven P. Gygi等于1999年提出。 Gygi首次用ICAT试剂对在不同碳源生长条件下的酵母细胞蛋白质表达水平上的差异进行了定量比较,并对该方法的方法学进行了确证. (Gygi S P, Rist B, Gerber S A, et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotech, 1999, 17(10):994-999) 三、ICAT原理 利用同位素亲和标签试剂预先选择性地标记含半胱氨酸的肽类，分离纯化后通过质谱进行鉴定，根据质谱图上不同ICAT试剂标记的一对肽段离子的强度比例，定量分析它的母本蛋白质在原来细胞中的相对丰度。 当对两种蛋白质样品进行比较分析时,分别加入轻型和重型ICAT试剂,待反应完后将两种样品等量混合,TPCK-胰蛋白酶水解,过生物素亲和层析柱分离,ICAT标记的肽片断吸附在柱上,然后洗脱进行液相色谱-质谱分析。不同来源的同种多肽会成对并相邻地出现在质谱图上,且分子量差值为8u或4u (若肽段带2个电荷),两者峰面积的差别即为两样品中同一种蛋白质表达的差异。 I 3.1、ICAT结构 三部分：化学反应基团（与蛋白质半胱氨酸残基SH专一反应；中间连接子（结合稳定同位素）；亲和反应基团（一种生物素亲和标签，与生物素结合选择分离ICAT标记的多肽）。试剂分为两种形式，连接子含有8个氘原子为“重型”，含有8个氢原子为“轻型”，这两种形式的ICAT试剂质量相差8D（肽段带两个电荷时相差4D）。 3.2、ICAT技术的过程 (1)利用重型和轻型ICAT试剂分别标记两种不同的蛋白质样本，标记完全后混合，用胰酶水解成大小不同的肽段； (2)使用生物素亲和层析法分离纯化与ICAT试剂反应的肽段; (3)标记的肽段洗脱后经液相色谱再次分离，串联质谱分析峰型一致的一对肽段峰的离子强度，由此即可推断出两种样品中同一种蛋白的相对含量。 (A)A protein occurs in higher copy number in cell state 1 than in cell state 2. In the example the ratio is 4:1. Cysteine-containing proteins from a cell extract are labeled with the normal (cell state 1) and the deuterated form of a blocking reagent (cell state 2). After digestion with trypsin, the protein extracts are mixed and cysteine-containing peptides selectively retrieved via a biotin tag on the blocking reagent. (B) Peptides are measured by mass spectrometry, and the otherwise identical peptides will be separat