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实验三葡聚糖凝胶柱层析
实验三、葡聚糖凝胶柱层析 1、目的与要求: 1.1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理; 1.2、掌握葡聚糖凝胶(Sephadex)柱层 析的操作技术。 2、凝胶层析法的原理: 凝胶层析是一种液相层析,机理是分子筛效应。当洗脱开始以后,小分子可进入凝胶颗粒内部,流程长,流动慢;大分子不能进入凝胶颗粒内部,流程短,流动快。这样就可使大小不同的分子分开。 Vt(total volume) Vo(outer volume) Vi(inner volume) Ve(elution volume) Vg(gel volume) Vt(床体积)=Vo+Vi+Vg , Ve(洗脱体积)=Vo+Kd×Vi。 Kd是分配系数:用于衡量物质在凝胶内外的分配率,是凝胶层析的一个特征常数,只与被分离物质分子大小和凝胶孔径大小有关,与层析柱的长短粗细无关。 Kd值的计算:Kd=(Ve-Vo)/Vi 几个特征Kd值意义: ①Kd=0,则Ve=Vo ,全排阻; ②Kd=1,则Ve=Vo+Vi , 全掺入; ③0<Kd1,则Ve=Vo+Kd×Vi ,部分掺入; ④Kd1,则VeVo+Vi , Sephadex 对它们有吸附作用。如某些芳香族化 合物(Phe,Tyr,Trp等), 2.1、影响凝胶层析分离的因素: 1、样品的体积、粘度; 2、层析柱 ;(高度,内径,材质) 3、洗脱液流速的影响 过慢:扩散 过快:拖尾 4、洗脱液离子强度、PH的影响。 2.1.1、样品的体积、粘度: 分析分离时:Vsample=1-4%Vbed; 制备分离时:Vsample=25-30%Vbed. 分离体积(Vsep):相邻两组分Ve之差,用 于衡量相邻两组分的分离效果。 Vsep=Ve1-Ve2 , 当VsampleVsep时,则相邻两组分可完全分离。 相对粘度:样品液粘度与洗脱液粘度的比值。 分离效果只与相对粘度有关,一般来说, 相对粘度不得超过1.5―2。 今天的上样量(0.2ml)约为1%柱床体积。 2.1.2、层析柱: ①柱长:组别分离时,5-30厘米; 分级分离时,可长至100厘米; ②柱径:分析分离时,由于样品量少, 常使用1厘米直径的层析柱,若制备分离时样品量大,最好使用直径2-3厘米的层析柱。 今天选用的是1cm ×30cm的层析柱。 2.1.3、洗脱液的离子强度和pH值的影响: 多糖类,水是最佳洗脱剂; 蛋白类,离子强度>0.02M的盐溶液作洗脱剂, 以消除凝胶的吸附作用; PH>7时,酸性物质易被洗脱; PH<7时,碱性物质易被洗脱。 2.2、凝胶层析法的应用: 1、分子量的测定用已知分子量的标准蛋白洗脱制备标准曲线。 2、分离多组分混合物 3、脱盐与分离纯化用于脱盐的凝胶多为大颗粒、高交联度的凝胶。此时,溶液中大分子(如蛋白质)的kd=0,盐类的kd=1,易于分离脱盐。 如: 用于去除热原物质热源是微生物产生的某些可以使人发热的物质,多为内毒素,是制药中必须去除的物质。内毒素是一个含脂肪A、糖类和蛋白,是带负电的复合大分子。内毒素经常是多聚体,凝胶过滤层析可有效地将之去除,特别是在小分子药物。选用的凝胶可以与脱盐类似,只是此时热源等大分子物质的kd=0,而小分子药物的kd=1 3、凝胶介绍: 凝胶是一种具有立体网状结构的物 质(如葡聚糖、琼脂糖、聚丙 烯酰胺等)吸收大量液体(水或洗脱液)溶胀而成。 3.1、层析用凝胶必须具备 下列条件: 1、惰性:保证其不与待分离物质发生化学反应; 2、稳定; 3、低电荷:避免离子交换效应的发生; 4、足够的机械强度:在一定的操作压下不形变。 3.2、能用于层析的凝胶主 要有下面几种: 2.2.1、天然凝胶: 马铃薯淀粉凝胶、琼脂及琼脂糖凝胶 。 2.2.2、人工合成凝胶: 聚丙烯酰胺凝胶 、交联葡聚糖凝胶 。 交联葡聚糖凝胶 : 是凝胶层析法中使用最广泛的一类层析凝胶,商品名称:Sephadex。其基本骨架是葡聚糖,它是由右旋葡萄糖残基通过α-1,6糖苷键连接而成,葡聚糖分子之间通过醚桥(甘油基)交联形成三维空间网状结构 3.3、葡聚糖凝胶Sephadex)的使用原则 2.4.1、型号选择: 组别分离时,Sephadex G-25最为常用。例如 样品中缓冲液的更换,蛋白质的
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