靳三针疗法对窒息脑瘫幼鼠神经干细胞增殖与分化的实验研究.pdf

2010年 5月第27卷第3期 广州中医药大学学报 May2010，Vo1．27，No．3 JournalofGuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine 231 · 针灸与经络研究 · 靳三针疗法对窒息脑瘫幼 鼠神经干细胞增殖与分化的实验研究 刘 乡 ， 柴铁劬 ， 孙 娟 ， 张 瑞 ， 孟令杰 ， 赵 丹 ， 周健洪 ， 陈东风 (1．广东省第二中医院，广东广州 510095；2．广州中医药大学，广东广州 510405) 摘要：【目的】观察靳三针疗法对脑瘫大鼠神经干细胞 (NSCs)增殖与分化的影响。 【方法】选用sD新生大鼠，随机分为 假手术组、模型组、靳三针疗法治疗组 (治疗组，针刺百会 、颞 I针、曲池、内关、足三里、涌泉)，模型组与治疗组均 采用结扎单侧颈总动脉法复制脑瘫大鼠模型，其中治疗组于手术后24h开始针刺，共 14d。各组于造模后 15d处死大鼠制 备脑组织提取液。另取健康 SD新生大鼠，取大脑海马部位，分离、扩增NSCs，采用免疫细胞化学法检测NSCs特征性标 记Nesfin与Brdu表达，以鉴定培养的细胞及体外分化能力。培养细胞分为正常对照组，低、高浓度纽 (分别加入 100、 300 l／mL的治疗组脑组织提取液)，培养 1、3、5d后，采用免疫细胞化学法和免疫荧光法检测各组神经元样细胞和星形 胶质样细胞的特征性标志物神经丝蛋白 (NF)和胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达，观察各组 NSCs分化情况。采用流 式细胞术检测各组NF、GFAP阳性细胞数，观察脑组织提取液促进NF、GFAP表达的时效和量效关系。 【结果】扩增后的 细胞球Nestin与Brdu均呈阳性，证 实体外培养的细胞为 NSCs，并处于分裂增殖旺盛期。细胞培养 1、3、5d后，NF、 GFAP染色均呈阳性，且正常对照组阳性细胞少，低、高浓度组明显增多，呈浓度依赖性，表明NSCs已分化为神经元细胞 和星形胶质细胞。同一时间段内低、高浓度组NF、GFAP阳性细胞数均较正常对照组显著增高 (P0．05或P0．01)，高 浓度组在培养 1、3、5d后，NF、GFAP阳性细胞数也显著增高 (P0．05或P0．01)，表明治疗组脑组织提取液可促进 NF、GFAP表达，且呈一定的量效和时效关系。【结论】靳三针疗法治疗脑瘫可能是通过促进 NSCs的增殖和定向分化 ，从 而达到修复脑损伤的 目的。 关键词：靳三针疗法／治疗应用； 脑性瘫痪／针灸疗法； 神经干细胞／病理学； 细胞培养 中图分类号：R246．6 文献标志码 ：A 文章编号：1007—3213 (2010)03—0231—05 脑性瘫痪 (cerebralpalsy，CP)是小儿先天性 细胞的增殖，调节其定向分化，以促进 自身修复， 或围产期所发生的脑功能障碍性综合征，以中枢性 这已成为治疗脑瘫新 的研究热点。本实验采用 运动障碍及姿势异常为主，常伴发智力低下、癫 “靳三针”针刺后的窒息脑瘫幼 鼠模型脑组织提取 痫、语言障碍、视听异常等多重残障，是继脊髓灰 液进行神经干细胞培养，观察该法对神经干细胞增 质炎被控制后近代最常见的儿童致残性疾病 一。目 殖与分化的影响，现报道如下 。 前国内外多种CP康复手段虽有一定疗效，但仍无 明显突破。 “靳三针疗法”是著名针灸学家靳瑞教 1 材料与方法 授经多年临床实践，汲取古代针灸配穴理论而创造 1．1 主要试剂及仪器 D—Hanks液 、L—DMEM、1 的具有独特理、法、方、穴、术的针灸疗法，对 mol／L胰蛋白酶、胎牛血清 (FBS) 由GIBCOL公 cP患儿多种症状改善有 良好的临床效果 ～。。 司提供，链霉亲和素生物素复合物 (SABC)、二氨 神经干细胞 (neuralstemcells，NSCs)是脑 基联苯胺 (DAB)染色试剂盒 由武汉博士德公司 内具有 自我复制能力和多向分化潜能的细胞 团，在 提供，神经丝蛋 白 (neurofilament，NF)、神经胶质 脑损伤后可以被激活并增殖、迁移及分化，使损伤 纤 维 酸 性 蛋 白 (glialfibrillary a