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基因芯片技术简介 中山大学附属第五医院 药剂科 临床药学室 冷薇 2009年8月20日 简介 随着人类基因组（测序）计划（Human genome project）的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展 ——越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正以前所未有的速度迅速增长。 ——建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要了。 简介 基因芯片（又称DNA芯片、生物芯片） 得益于 探针固相原位合成技术与照相平板印刷技术 激光共聚焦显微技术 基因芯片（gene chip）的原理 基因芯片的测序原理是杂交测序法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置 ，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶序列的核酸。 基因芯片又称DNA微阵列（DNA microarray） 三种主要类型： 1）固定在聚合物基片（尼龙膜、硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段——通过同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测 2）用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列——通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测 3）在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列——与荧光标记的靶基因杂交进行检测 主要类型 多种方法将寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上 原位合成（in situ synthesis） 合成点样 支持物： 玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等 原位合成法 主要为光引导聚合技术（Light-directed synthesis），不仅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。 主要步骤为： 首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来。 每次选取适当的蔽光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。 每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。 原位合成 压电打印法（Piezoelectric printing） 美国Incyte Pharmaceuticals公司 其装置与普通的彩色喷墨打印机相似，采用常规的固相合成方法。 做法： 将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂所替代，支持物经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相原位合成技术。 合成点样 在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的DNA或多肽固相合成仪以完成。 合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。 支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷。 基因芯片的相关技术——样品的准备 由于灵敏度所限，多数方法需要在标记和分析前对样品进行适当程序的扩增，不过也有不少人试图绕过这一问题 如： Mosaic Technologies公司引入的固相PCR方法，引物特异性强，无交叉污染并且省去了液相处理的烦琐； Lynx Therapeutics公司引入的大规模并行固相克隆法（Massively parallel solid-phase cloning），可在一个样品中同时对数以万计的DNA片段进行克隆，且无需单独处理和分离每个克隆。 显色和分析测定方法 主要为荧光法 重复性好，灵敏度仍较低。 存在的问题是： 只要标记的样品结合到探针阵列上后就会发出阳性信号，这种结合是否为正常配对，或正常配对与错配兼而有之，该方法本身并不能提供足够的信息进行分辨。 目前正在发展的方法： 质谱法、化学发光法、光导纤维法等 荧光检测法 1）用荧光素标记扩增（或其他放大技术）过的靶序列或样品 2）与芯片上的大量探针进行杂交，将未杂交的分子洗去（如果用实时荧光检测可省去此步） 3）用落射荧光显微镜或其他荧光显微装置对片基进行扫描，采集每点荧光强度并对其进行分析比较 生物芯片基本步骤 生物芯片是将生命科学研究中所涉及的不连续的分析过程（如样品制备、化学反应和分析检测），利用微电子、微机械、化学、物理技术、计算机技术在固定芯片表面构建的微流体分析单元和系统，使之连续化、集成化、微型化。 主要包括四个基本要点： 1）芯片方阵的构建 2）样品的制备 3）生物分子反应 4）信号的检测 芯片制备 芯片制备，先将玻璃片或硅片进行表面处理，然后使DNA片段或蛋白质分子按顺序排列在片芯上 目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微距阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序