第七章：酶联免疫吸附试验.pptVIP

（+） E E E E E E （-） E E E 4.操作步骤 （五） 双抗原夹心法检测抗体 用同一种抗原分别作为酶标抗原和固相抗原以检测抗体的方法 用于抗体的检测 1．原理 2．应用 E 固相抗体 标本（含抗体） 酶标抗原 底物 E E 3.原理 （+） （-） E E E E E E E E E 4.操作步骤 （六）竞争法检测抗体 同竞争法结合抗原。 HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法，但其测定具体模式有区别。 1．原理 （1）竞争法检测HBcAb： ①将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。 ②加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。 ③加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。 2．技术要点 固相抗原 标本（含抗体） 底物 酶标抗体 E E E E E 竞争法检测HBcAb （2）竞争法检测HBeAb： ①将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。 ②加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。 ③加入酶标HBeAb，温育，洗涤。 ④加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。 固相抗体 标本（含抗体） 抗原 酶标抗体 底物 E E E 竞争法检测HBeAb （七）捕获法 1.概念 先用固相化的抗人IgM抗体捕获IgM，再用特异性抗原及其酶标抗体检测相应的IgM 2.应用 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法 3.原理 采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF（IgM类）能与固相抗人μ链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导致假阳性反应。 4．注意事项 非特异IgM由于其在第一步温育中，可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测IgM，必须对临床样本进行适当稀释。 三、技术要点 （一）常用的固相载体 1.聚苯乙烯——目前最常使用 （1）蛋白质吸附性能较强，保留免疫活性，价格低廉，不参与化学反应。 （2）形状 小试管、小珠和微量反应板。 最常使用的载体是微量反应板，也称为ELISA板。国际通用标准板形是8×12的96孔板，也有8×6的48孔板。 ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特定的比色计上迅速读出结果。 微量反应板 返回章目录 2.聚氯乙烯 与聚苯乙烯类似，特点为质软板薄，可切割，价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 3.微孔滤膜 如硝酸纤维素膜、尼龙膜等。 4.含铁的磁性微粒 四、测定方法 （一）加样加液体 ELISA中一般需进行1次加样和4-5次加液。在定性测定中虽不特别强调加液量的准确性，但也需要标准化。例如规定为加液一滴，加液时加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出现气泡。在定量测定中则加样加液量应力求准确。 （二）温育 1.在ELISA中一般有2次抗原抗体反应，一次酶促反应，反应的温度和时间应按规定的要求进行。 2.一般采用水浴，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡，为避免蒸发，可用塑料贴封纸覆盖板孔。 微量反应板 返回章目录 （三）洗涤——决定着实验的成败 1.洗涤的目的是洗去没有与固相抗原或抗体结合的物质以及反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。 2.洗涤方式：自动洗板机和手工操作。 第七章 酶免疫技术 医学技术系检验教研室段慧英 免疫标记技术 定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素等标记已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 2.分类： 放射免疫技术 荧光免疫技术 酶标记技术 发光免疫技术 金标免疫技术 酶免疫技术概述 1、概念 以酶作为标记物标记试剂抗原或试剂抗体，抗原抗体反应后，通过检测酶促反应产物，以检测相应抗体或抗原的分析方法。 酶免疫技术概述2、分类 酶免疫组化 用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体 酶免疫技术 均相酶免疫测定 酶免疫测定 固相酶免疫测定 异相酶免疫测定 （ELISA） 液相酶免疫测定 酶免疫技术概述 3、酶免疫测定的特点 几乎所有的可溶性抗原系统均可以检测 酶免疫测定具有高