微生物学第四章 酶的分离纯化.pptVIP

①加入饱和硫酸铵溶液 溶液体积不大，要达到的盐浓度不高 ②加入固体硫酸铵 当溶液体积较大，要达到的盐浓度又较高 2、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素： （1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。 （2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。 （3）pH值和温度：等电点附近，室温或低温操作。 （5）脱盐：超滤、透析或层析。 （4）蛋白质浓度：一般控制在2.5~3.0% 为宜。 （二）有机溶剂沉淀法 1、作用原理 ①去水膜；②降低介电常数；③破坏氢键。 2、操作注意 低沸点，易燃易爆；低温操作，沉淀析出后要尽快分离。 （三）等电点沉淀 1、原理 2、实际操作 与其他方法一起使用（盐析、有机溶剂沉淀、复合沉淀）。 单独使用时，主要是用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白 。 3、注意 加酸碱调节pH值时，防止局部酸碱过高。 （四）选择性变性沉淀法 1、热变性法：根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异，可以在较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。 2、酸碱变性法：目的酶与杂蛋白的酸碱稳定性不同，可以调整pH使杂蛋白变性沉淀。 选择一定的条件使酶液中存在的某些蛋白质等杂质变性沉淀，而不影响所需的酶。 第二节 酶的沉淀分离、离心和膜过滤技术 盐析沉淀法√ 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 选择性变性沉淀法 第二次作业： 1、设计一套详细方案，从自然界中筛选产蛋白酶的微生物菌种。 二、膜过滤技术在酶分离纯化中的应用 借助于一定孔径的半透膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术。 二、膜过滤技术在酶分离纯化中的应用 膜分离技术已被国际上公认为20世纪末至21世纪中期最有发展前途，甚至会导致一次工业革命的重大生产技术，所以可以称为前沿技术，是世界各国研究的热点。 广泛应用于生物工程、化学、制药、饮料、电力、冶金、海水淡化、资源再生等领域。 渗出液 膜分离技术的地位和影响 美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一种技术，能像膜技术这么广泛地被应用” 日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研究和开发。 “谁掌握了膜技术，谁就掌握了化学工业的未来”- Norman N. Li，美国科学院院士，著名华裔科学家。 膜分离已得到广泛应用。21世纪是工业生物技术的世纪，膜技术将扮演重要角色。 * * 第四章 酶的分离纯化 及产品成型 第四章 酶的分离纯化及产品成型 重点（2）酶的分离纯化：沉淀分离、离心 分离、膜过滤、层析分离、电泳分离 （4）酶纯化过程 的纯度监测 本章知识点： （1）细胞的破碎、酶的提取 （3）酶液的浓缩、结晶、干燥、成型 一、生物下游加工技术 下游加工过程包括目标产物的提取、浓缩、纯化及 成品化等过程。 大多数酶的回收纯化过程成本约占70%； 医用酶的生产回收过程的成本高达85%； 基因工程表达产物的回收纯化过程成本一般占85-90%以上； 青霉素回收过程成本约占50%； 乙醇的回收过程成本仅占14%。 二、分离纯化的一般流程 发酵液 细胞分离（离心、过滤） 细胞 清液 细胞破碎 碎片分离 粗分离 纯化 成品化 线路2 线路1 （胞内酶） （胞外酶） 预处理 发酵液 预处理 细胞分离 细胞破碎 细胞碎片分离 初步分离 纯化 成品加工 （胞外酶） 首先，应对被纯化的酶的理化性质有一个比较全面的 了解; 其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以活力 回收率和纯化倍数为指标； 再者，在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤 和条件； 最后，要严格控制操作条件。 在实践工作中选择方法时: 酶分离纯化方法 离心分离、凝胶过滤、膜分离 盐析沉淀、有机溶剂沉淀、共沉淀、 等电点沉淀 离子交换层析、电泳分离、等电聚焦 选择性热变性法、选择性酸碱变性法、选择性表面变性法 亲和层析、免疫电泳、免疫沉淀 分离依据的性质 分离方法 分大小、轻重 溶解度大小 稳定性差异 电荷性质 亲和作用 发酵液 预处理 细胞分离 细胞破碎 细胞碎片分离 初步分离 纯化 成品加工 （胞外酶） 第一节 酶的提取分离（酶溶液的制备） 方法：（1）加热 适用于耐热的酶，加适当的酶保护剂。 （2）加凝聚剂或絮凝剂 （3）调pH值 一、发酵液的预处理 目的：降低粘度，便于固液分离。 发酵液 预处理 细胞分