教案6核酸分子杂交.ppt

2、洗膜的时间与次数： 一般用2XSSC洗1－2次，然后用严格的洗液洗2次，每次30分钟。 * 八、脱探针的方法及注意事项 ： 尼龙膜可以重复利用，因此杂交后不能干燥，一定保持湿润。 处理方法：0.1X SCC/0.1%SDS、100℃ 5－10分钟 DNA的膜还可以用0.2N NaOH处理 * 九、标记的方法 1、缺口平移法 （Nick Translation） 原理及过程： 反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I 5’ → 3’外切酶活性，在缺口处按5’→ 3’方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5’ → 3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。 * * 2、随机引物法（6核苷酸引物标记法） 原理及过程：利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5’→ 3’聚合酶活性。 被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3’端为起点，沿模板3’ → 5’方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。 * * 3、末端标记 * （2）交换反应标记法 * 十、标记的种类 理想的标记物： ①具有高度的灵敏性 ②与探针结合后，不影响杂交及探针的主要理化特性 ③检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率低，环境污染少，价格低廉； ④若用酶促方法标记，应对Km影响不大 * 1、同位素 [α-32P]dNTP、[α-32S]dNTP用缺口平移法和随机引物法 γ-32P-ATP用于末端标记 放射性同位素（radiosotlope）是不稳定的，它会“变”。放射性同位 素的原子核很不稳定，会不间断地、自发地放射出射线，直至变成另一种稳定同位 素，这就是所谓“核衰变”。 放射性同位素衰变的快慢，通常用“半衰 期”来表示。半衰期（half-life）即一定数量放射性同位素原子数目减少到其初始值一 半时所需要的时间。 * 同位素的特性： ①检测特异性强； ②灵敏度高； ③对酶促反应无任何影响，也不影响碱基配对的特异性和稳定性； ④易造成放射性污染； ⑤半衰期短的同位素应用受到限制，随用随标记，立即使用，不能长时间存放。 * 同位素 符号 半衰期 β射线能量（MeV） 氢-3 3H 12.3年 0.018 碳-14 14C 5720年 0.156 磷－32 32P 14.3天 1.71 硫－35 35S 87.1天 0.167 碘－131 131I 8.05天 0.605 常用同位素的特征 * * 2、非放射性标记 优点：无环境污染，可较长时间贮存 方法：1.酶标记法 2.化学标记法 要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异亲和性、分子量小，对探针杂交无影响或影响甚小，不影响DNA三维空间构象的形成。 常用的标记物：生物素（biotin）、地高辛（digoxigenin）、光生物素（photobiotin）、补骨脂素、2-乙酰氨基芴（2-acetylomino fluorene） * 地高辛（Digoxigenin 简写Digo-）又称异羟基洋地黄毒甙配基，这种类固醇半抗原仅限于洋地黄类植物，其抗体与其它任何固醇类似物如人体中的性激素等无交叉反应，地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP）上形成digoxigenin –11-dUTP * 地高辛标记技术源于一种从洋地黄类植物（毛地黄和毛花毛地黄）中提取的类固醇（Steroid）物质—— Digoxigenin （DIG），在医学上可用于治疗各种急性和慢性心功能不全以及室上性心动过速、心房颤动和扑动等疾病。由于洋地黄植物的花和叶片Digoxigenin在自然界中的唯一来源，因此抗DIG的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要。这一点，正是DIG胜于生物素(Biotin)的地方——同样是小分子标记物，生物素广泛存在于各种组织中，对于灵敏度很高的标记检测实验来说，样品自身含有的内源生物素，就会对结果产生干扰。地高辛就能够很好地避免这个问题。 * 通过随机引物或缺口翻译法（多用随机引物法），将dig-11-dUTP与探针的核酸分子相连，构成Dig-配基标记的核酸探针。将这种标记的探针与核酸分子之间的同源序列在一定条件下互补杂交，然后用偶联有酶或荧光素的羊抗高地辛抗体Tab（抗原结合片段）结合物作为酶标或荧光标记，再分别用显色底物使杂交部位显色或产生荧光以达到检测目的。 对