质粒DNA的制备限制性内切酶切割重组质粒.ppt

质粒DNA的制备限制性内切酶切割重组质粒 朱文博 中山医学院 基因克隆 定义： 经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。 基因工程 定义： 实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称为基因工程，又称重组DNA技术。 2 提取大肠杆菌质粒DNA的方法和原则 2.3 核酸分离纯化的总原则： (1) 保证核酸一级结构完整 (2) 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、 有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等） 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用） * 溶液III：HAC(乙酸)和 KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液 (复性，分离) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。 ②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。 3.3 实验步骤 加1.4ml培养物于EP管，12000rpm×1min，去上清， 再加1.4ml培养物至原管， 12000rpm×1min，去上清 ? 加入冰的200 μl 溶液I，剧烈振荡EP管，室温放置3min ? 加入200μl 溶液II，快速颠倒数次，冰浴3min （不要振荡！） ? 加入150μl 冰溶液III，温和振荡10s，冰浴5min，12000rpm×5min ? 转移上清500μl到新EP管，加入等体积500μl的酚与氯仿/异戊醇的混合物（1:1混合），充分颠倒混匀， 4 ℃ 12000rpm×5min? 400μl上层水相转移到新的EP管，加入等体积400μl氯仿/异戊醇，颠倒混匀，4 ℃ 12000rpm?5min 400μl上层水相转移到新的EP管，加入2倍体积800μl无水乙醇，颠倒混匀， -20 ℃ 冰箱中放置15min， 4 ℃ 12000rpm?10min ? 弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇， 4 ℃ 12000rpm×5min 去上清，管平放室温静置5-10min， 20 μl TE 溶解DNA 注意事项： 1、加样枪正确使用； 2、标记自己所提取的质粒类型； 3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要换枪头； 5、离心前把管擦干； 6、转移上清时不要吸到沉淀； 7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到 皮肤； 8、 每人最终得到20ul质粒DNA，其中10ul用于酶 切和电泳，其余DNA储存于-20℃用于电泳对 照！ 二、限制性内切酶切割重组质粒 1 关于限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease） 1.1 定义 能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段。 主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。 * 1.3 作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。 1.2 分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型） 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 1.4 命名 Hin dⅢ 属 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 2 BamHI 、HindⅢ酶切质粒及鉴定 2.1 实验原理： 利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒DNA） * 重组质粒 BamHI Hind III 双酶切 电泳检测 5-G A A T T C-3‘ 3-C T T A A G-5 BamHI 5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind III PUC119（3.2Kb） U6启动