HBV HBx基因荧光真核表达质粒的构建及其运用于HBV复制机制的初步研究.pdfVIP

安徽 医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2013Nov；48(11) ·1297 · HBVHBx基因荧光真核表达质粒的构建及其运用于 HBV复制机制的初步研究 杨 凯，管世鹤，孙蓓蓓，潘 颖，吴园园，王爱华 摘要 目的 构建能够表达 HBx蛋白的绿色增强荧光蛋白一 1 材料与方法 HBx(pEGFP—N1一HBx)真核表达质粒 ，并探讨 HBx蛋 白对乙 型肝炎病毒 (HBV)复制的影响。方法 以HBVDimer为模 1．1 材料来源 HepG2细胞 由德国埃森大学陆蒙 板，PCR法扩增 HBx基因，PCR产物测序分析正确后克隆至 吉教授惠赠，细胞以含 10％胎牛血清的DMEM培养 真核表达载体pEGFP—N1，命名为pEGFP—N1一HBx。将该质粒 液常规传代培养。质粒 pEGFP-N1购 自美国Clon— 转染肝胚瘤细胞株HepG2，以RT—PCR法及荧光显微镜观察 tech公司；质粒HBVDimer、pHBV48．X0分别由德国 其表达情况，再通过基 因共转染等技术研究 HBx蛋 白对 HBV复制的影响。结果 酶切鉴定和序列分析证实构建质 埃森大学陆蒙吉教授和台湾大学 Ding—ShinnChen 粒含 HBx基因，RT—PCR法检测和荧光显微镜观察表明构建 教授惠赠。Lipofectamine 2000购 自美 国Invitrogen 的pEGFP—N1一HBx质粒在 HepG2细胞 中能够表达；质粒 公司；荧光定量 PCR检测试剂盒购 自上海克隆公 pEGFP—N1一HBx与pHBV48一X0共转染后，HepG2细胞上清液 司；ELISA试剂盒购 自上海长征复星公司。 HBV—DNA、HBsAg和HBeAg分泌显著增多。结论 HBx基 1．2 pEGFP-N1-HBx质粒构建 根据 HBV全 因克隆及其真核表达载体 pEGFP—N1一HBx构建成功 ；HBx蛋 DNA序 列 (ayw亚 型)(GenBank2182117)运 用 白能够促进 HBV复制及抗原分泌。 primerpremier5．0软件设计 HBx序列引物，上游引 关键词 乙型肝炎病毒；HBx蛋白；质粒 ；复制 物 HBxFH：5一CCATGGCTGCTAGGCTGTG．3；下游 中图分类号 R373．2；R512．6；Q343．3 弓I物 HBxRB：5一AGGCAGAGGTGAAAAAGTTGC一3。 文献标志码 A 文章编号 1000—1492(2013)11—1297—03 HBxFH和HBxRB的5端分别引人EcoR I(GAAT— TC)、BamHI(GGATCC)的酶切位点。反应条件： 乙型肝炎病毒 (hepatitisBvirus，HBV)感染肝 95℃预变性240S，95℃变性 30S，55cC退火 30S， 细胞后，能引起慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等 72℃延伸420S。PCR产物在 2％琼脂糖凝胶电泳 疾病 I2J。在HBV基因组编码的众多病毒蛋 白中， 鉴定大小。PCR纯化回收产物9Ixl，T载体 1txl， HBx蛋 白是一种多功能蛋 白，能与宿主细胞发生相 solu