第1章 生命大分子物质的制备.ppt

应用：农残分析，药物筛选，液相、气相、质谱分析前处理。 ?? 优点： ? 干燥速度快 ?? 缺点： ? 样品温度高 样品处理量少 存在将样品中物质吹到实验室中的风险，必须在通风橱 中操作 需要消耗氮气，增加额外成本 可燃溶剂存在爆炸危险 整个过程需要监控 第六节 纯化方案的设计与评价 使用上述方法破碎细胞时，一般应遵守如下规则： 如能用温和的方法就不采用强烈的方法。太强的破碎方法会使许多不需要的物质进入溶液中去。 上述方法既适合于破碎细胞也适合于破碎细胞器。若所需的物质处于细胞器内，可首先析出细胞器，然后再从中提取所需的蛋白质。纯化细胞器或许回收率较低，但是这样处理可减少许多杂质的干扰，是一个比较好的提取方法。在析出细胞器时，要尽可能地避免使用强烈的机械方法。 3. 对于一些难以破碎的细胞，最初可使用一些消化酶来消化细胞壁上的胶原或纤维物质，然后再用比较温和的处理方法破碎。这种方法适合于小规模的分离纯化，更适于细胞器的新陈代谢的研究。 第四节 抽 提Extraction 一、抽提的含义 抽提-----通常是指用适当的溶剂和方法，使原料中有效成分分离出来的过程。 理想的抽提溶液应具备下述条件： 1.???对有效成分溶解度大，破坏作用小 2.???对杂质不溶解或溶解度很小 3.???来源广泛、价格低廉、操作安全 对不同组织抽提的具体方法可参阅有关文献。 二、抽提有效成分的影响因子 　1.??pH值 　2.??溶剂的极性和离子强度 DMSO 　3.??水解酶 PMSF 　4.? 温度 　5.? 搅拌 　6.? 氧化 DTT PVP 疏基乙醇 　7.? 金属离子 1-3 mmol/L EDTA 　8.? 抽提液与抽提物的比例 5：1 第五节 浓缩 Concentration 低浓度溶液通过除去溶剂变为高浓度溶液的过程。常在提取后和结晶前进行，有时也贯穿于整个提取过程。 一、沉淀法 Precipitation 在抽提液中加入适量的中性盐(如(NH4)2SO4)或有机溶剂，使有效成分变为沉淀。经离心或过滤收集的沉淀物，加少量缓冲液溶解后，再经离心除去不溶物，获得的上清液，通过透析或凝胶过滤脱盐，即可供纯化使用。 二、吸附法 Adsorption 将干葡聚糖凝胶G25加入抽提液中，两者比例约为1：5。由于凝胶吸水之故，抽提液的体积可缩小三倍左右。回收蛋白质量约80％。 当凝胶对有效成分吸附力强或吸水后对有效成分的性质有影响时。此法不宜采用。 原理：利用压力、抽滤或离心力强行使溶质按大小形状的差异分开，强行使水和其它小分子溶质通过膜，而所需的分子被滤膜截留，以达到浓缩和脱盐目的。 加压 溶液 超滤膜 支持栅板 超滤液 三、超过滤法(Ultrafiltration) 四、透析法（Dialysis) 把装抽提液的透析袋埋在吸水力强的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG，分子量20Kda)或甘油中，10毫升抽提液可在1小时内浓缩到几乎无水的程度。 这种方法的浓缩速度与透析袋的表面积以及PEG的数量有密切关系。 五、减压浓缩法 将抽提液装入减压蒸馏器的圆底烧瓶中，在减压真空状态下进行蒸馏(见图)。当真空度较高时，溶液的沸点可控制在30℃以下。 这种方法一般适用于常温下稳定性好的物质。 六、冰冻干燥法 冰冻的抽提液在真空状态下，可以由固体直接变为气体。用此原理进行浓缩，有效成分几乎不会破坏。 冻干机主要由低温干燥箱、真空泵和冷冻机构成。 Freeze-dryer 七、氮吹法 原理：将氮气快速、连续、可控地吹向加热样品的表面，使待处理样品中的水分迅速蒸发、分离，实现样品无氧浓缩。 ?? 高级生物化学与分子生物学研究技术原理 Principles of Advanced Biochemical and Molecular Biological Technology 陈 云 第一章 生命大分子物质的制备 生命大分子物质通常是指动物、植物和微生物进行新陈代谢时所产生的蛋白质(包括酶)和核酸等有机化合物的总称。 它不仅是生物科学工作者研究的重要对象。而且与化学、医学和食品等工业部门有密切关系。 生物大分子物质分离纯化的一般步骤: 层析法 电泳法 超离心法 透析和超滤 盐析（硫酸铵盐析） 等点电沉淀 有机溶剂沉淀 离心 │←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│ 材料选择与处理 细胞破碎 有效成分的抽提 浓缩 生物组织→ →提取液→ →粗产品→ →干燥与保