蛋白质的分离、纯化与特性.pptVIP

一 蛋白质分离纯化的一般原则 (一) 抽提(前处理)(pretreatment): 生物材料 ? 组织和细胞破碎(匀浆器，组织捣碎机超声破碎，酶处理）?差速离心 ?分离细胞组分（细胞器、膜、细胞质） (二) 粗分级分离 (rough fractionation)； ?去除杂蛋白、核酸、多糖等 （等电点沉淀法，盐析法，有机溶剂沉淀法等） (三) 细分级分离 (fine fractionation) ?去样品的进一步纯化 （层析法，电泳，结晶等）;二 蛋白质变性 1 变性作用 (denaturation): 在物理或化学因素的作用下，蛋白质次级键破坏，引起天然构象的解体，蛋白失去生物活性的现象。 变性过程不涉及共价键（肽键、-S-S-）的断裂 变性蛋白的变化： 生物活性丧失： 理化性质：溶解度下降、沉淀；化学反应性改变 生化特性：比活、免疫特性、易被蛋白酶水解、 光谱特性改变 2 变性的可逆性：复性 (renaturation) ;3 使蛋白质变性的因素及其作用机制：;（一）根据分子大小不同的纯化方法 1 透析(dialysis)和超滤 (ultrafiltration) 2 密度梯度(区带)离心：沉降分析 可用于分离、纯化和测定蛋白质或其他生物大分子的相对分子质量。 s ：沉降系(常) 数：单位离心场的沉降速度 蛋白质、核酸、病毒等的s介于1× 10-13 ~200×10-13秒 S：斯维得贝格单位(Svedberg unit)或沉降系数单位 1 S = 10-13秒 沉降速率法(sedimentation velocity): 梯度溶液(蔗糖,甘油等)的密度 ? 蛋白质密度 沉降平衡法(sedimentation equilibrium): 梯度溶液(CsCl等)的密度 ? 蛋白质密度 ;3 凝胶过滤 (gel filtration chromatography) 可用于蛋白质的分离纯化及分子量测定 也称：分子排阻层析 、分子筛层析——柱层析 介质：具有多孔网状结构的凝胶颗粒（珠） 琼脂糖凝胶（Sepharose），聚丙烯酰胺凝胶， 交联葡聚糖凝胶（Sephadex）等 分级范围 ：所能分离开的蛋白质分子量范围。取决于 凝胶网孔的大小。如Sephadex G-50的 分级范围1,500 ~ 30,000，脱盐 排阻极限 (exclusion limit)： 分级范围的分子量上限。;（二）利用溶解度差别的纯化方法;3 盐析和盐溶： 盐溶作用(salting in): 低浓度中性盐可以增加蛋白质的溶解度 盐析作用(salting out): 当溶液的离子强度增加到一定数值时，盐离子与蛋白争夺水化层，使蛋白质溶解度开始下降，甚至逐步从水溶液中析出、沉淀的现象。 常用盐析盐类： (NH4)2SO4 ，NaCl等 4 有机溶剂分级分离法：低温操作（- 40 ~ -60°C） 甲醇、乙醇、丙酮， 氯仿、苯酚 5 生物碱试剂沉淀法 ：鞣酸、苦味酸等 ;1）聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE，polyacrylamide gel electrophoresis) 凝胶柱或凝胶板: 丙烯酰胺单体(Acr)+双体(Bis) 浓缩胶(大孔径，使样品浓缩) 分离胶（小孔径，分离样品） 不连续性：凝胶的浓度(孔径大小)、缓冲液组分 和离子强度、pH 及电场强度不同 在PAGE过程中的3种物理效应： ?样品的浓缩效应(慢离子Pr 快离子) ?分子筛效应 (小分子在前) ?电荷效应 ; 2）等电聚焦(isoelectric focusing, IEF) 利用等电点不同加以分离的电泳技术 pH梯度：脂肪族多胺和多羧类的同系物 分辨率非常高，可用于分离、鉴定和等电点???定 2