西兰花硫代葡萄糖苷酶基因bomyr2在毕赤酵母中的表达 functional expression of the myrosinase bomyr2 from brassica oleracea var. italica in yeast pichia pastoris.pdfVIP

第10卷第1期 中国食品学报 V01．10No．1 201 0年2月 ofChineseInstituteofFoodScienceand Feb．201 0 Journal TechIlolog)r 西兰花硫代葡萄糖苷酶基因BoMyr2在毕赤酵母中的表达 梁锦锋 沈莲清 王向阳 顾 青 (浙江工商大学食品和生物工程学院杭州310035) 摘要 以西兰花种子总RNA为模板，通过RT-PCR方法扩增西兰花BoMyr2成熟蛋白基因．将目的片段连接到 pMDl8一T载体，测序结果显示扩增片段与目的序列一致。通过目的片段的酵母表达栽体pPIC9K的构建．获得 重组酵母表达栽体pPIC9K—BoMyr2，经SacI线性化后电转导入毕赤酵母茵株(陬hiapastorisKM71)。经甲醇 诱导表达试验，SDS—PAGE结果显示，表达上清中舍有大小约65kD的蛋白条带，与预期分子质量大小相符。以 sini断n为底物测定表达上清的酶活性，结果显示，通过毕赤酵母KM71表达的培养液具有硫代葡萄糖苷酶活 性。硫代葡萄糖苷酶在KM71中的异源表达，为进一步研究与应用提供理论基础。 关键词 西兰花；硫代葡萄糖苷酶；BoMyr2基因；毕赤酵母；分泌表达 文章编号1009—7848(2010)01—0067—06 蛋白数据库(PDB)中已测定三维结构的硫代 葡萄糖苷酶(简称硫苷酶)均存在糖基化现象。利 下游的多克隆位点(MCS)上．转化毕赤酵母，以期 用不同模型对GenBank中已登录的硫苷酶全长 在培养基质中得到一定量的被适度糖基化修饰的 cDNA序列进行信号肽预测。结果发现其编码基蛋白产物。为进一步论证酶的糖基化在硫苷酶活 因均含有一段典型的信号肽编码序列．说明硫苷 性以及空间结构正确折叠及其稳定性等方面的作 酶蛋白在黑芥子酶细胞ER膜上合成并转运到黑 用．为研究西兰花硫苷酶三维结构及硫苷酶相关 芥子酶颗粒的过程中发生了糖基化反应。利用 蛋白奠定基础。 pGEX一4T一1在大肠杆菌BL21中进行硫苷酶蛋白 融合表达．结果发现该表达产物缺乏酶活性(已完 1材料与方法 成，数据未公开)。上述现象说明硫苷酶的糖基化 1．1 植物材料和菌株、质粒 修饰可能对于酶空间结构的正确折叠及其酶催化 大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5a菌株，浙江 活性具有重要作用。 TVector，宝生物 大学生物技术所惠赠：pMD一18 酵母表达系统对外源基因表达产物具有一定 的翻译后加工能力．收获的外源蛋白质存在一定 本实验室提取、保存。来源于西兰花种子(山西本 程度上的折叠加工和糖基化修饰．其性质较原核 地栽培种)，浙江省农科院十字花科植物研究组钟 表达的蛋白质更加稳定。特别适合于表达真核生 新民研究员惠赠；酵母表达载体pPIC9K及宿主 物基阒和制备有功能的表达蛋白质。利用酵母体 菌KM71，本实验室保存。 系表达硫苷酶已有2例报道。Chen等首次报道了1．2酶和主要试剂 将甘蓝型油菜MYRl基阒整合到酿酒酵母中表达 DNA琼脂糖胶纯化试剂盒，上海华舜生物工 硫苷酶【I】。Frauke等用相同基因在毕赤酵母中进行 程有限公司产品：质粒抽提：采用BioDev—TechB 甲醇诱导表达，得到有活性的产物121。本文将硫苷 型质粒小量提取试剂盒。To,／酶、高保真p危酶、限 制性内切酶SacI、SnaBI、NotI、T4DNA连接酶， NEB公司产