重组蛋白包涵体表达的复性和纯化.pptVIP

重组蛋白药物包涵体表达、复性和分离纯化 姓名：何云凤 时间 2 发酵液 细胞分离 胞内产物 胞外产物 细胞破碎 固液分离 包涵体 细胞碎片分离 变性 复性 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品 基因工程制品分离纯化的一般流程 包含体的形成和性质 在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物 包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各种原因导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽然正确，而其高级结构是错误的，即：没有生物活性的包涵体。包涵体直径约0.5-1μm，具有很高的密度（约1.3 mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。 包涵体形成的几种可能性 研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成包涵体。 1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其在细胞内溶解度时沉淀； 2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对； 3）重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。 4）重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多、Pro含量越高越容易形成包涵体。 5）重组蛋白所处的环境：发酵温度高时容易形成包涵体。 包涵体形成：Advantages 1、细菌的生长快速利于大规模生产。包涵体形式表达的蛋白质浓度比较高，有时甚至可以达到细胞总蛋白含量的40% 2、重组蛋白质以包涵体形式存在→包埋了酶攻击的位点，可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击 3、分离比可溶蛋白质的分离方法简便，造价低，使用简单的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离 4、有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死，大量表达时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低；而包涵体形式的蛋白质因丧失了生物活性→高效地表达 包涵体加工流程 离 心 去除细胞碎片 （ 膜蛋白和脂类等） 机械破碎法 包涵体提取 如何对包涵体蛋白进行高效体外复性以获得活性产品是生物工程产业化的一个难题 细胞破碎就是采用物理、化学、酶或机械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中。 细胞破碎 分 类 作用机理 适应性 物理破碎 高压匀浆法 液体剪切作用 可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌 珠磨法 固体剪切作用 可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难 超声破碎法 液体剪切作用 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作 渗透压法 渗透压剧烈改变 破碎率较低，常与其他方法结合使用 反复冻融法 反复冻结-融化 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物 干燥法 改变细胞膜的渗透性 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活 X-press法 固体剪切作用 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合 化学破碎 酶溶法 酶分解作用 具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差 化学渗透法 改变细胞膜渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差 常用破碎方法（按细胞所受作用） 包涵体的洗涤 细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。 洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。 洗涤剂：温和的表面活性剂（Triton X-100）、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。 洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。 包涵体的溶解 二硫键 目 的 次级键 变性剂 去污剂 还原剂 盐酸胍、尿素 SDS、Triton 100 巯基乙醇、DTT 蛋白质的复性：包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。 如何使包涵体的构型复原成正确状态？ 复性常用方法 稀释\透析\超滤复性法 折叠促进剂协助复性法：表面活性剂、PEG、分子伴侣等 反相胶团复性法、双水相体系复性法 层析折叠复性（