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等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步 测定1 常灏，黄耀江，沈光涛 中央民族大学生命与环境科学学院，北京（100081 ） E-mail：haobio@163.com 摘 要：作为一种新型的速效局部止血药和工具酶，凝血酶在临床和生物学研究中的应用十 分广泛，牛血浆是其重要的来源之一。等电点沉淀是提取牛凝血酶首要和关键的步骤，测定 其等电点后，再用此法时将得到更纯的凝血酶粗制品。本实验的目的是通过测定胰蛋白酶的 等电点建立载体两性电解质等电聚焦电泳的方法，并以该方法结合 SDS测定牛凝血 酶的等电点。经双向电泳后，SDS 聚丙烯酰胺凝胶中出现了 4 个清晰的斑点，分别测定它 们的分子量和等电点，其中一个斑点与牛凝血酶 B 链的分子量一致为 32kDa ，其等电点为 5.19。 关键词：牛凝血酶，等电点，等电聚焦，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. 引言 凝血酶（Thrombin，EC ）是一种丝氨酸蛋白水解酶，在血液凝固系统中起重要 作用。它能催化溶胶态的纤维蛋白原转变为凝胶态的纤维蛋白，同时促使血小板聚集，加速 血液凝固，达到迅速止血的目的。[1][2]凝血酶在参与凝血作用的同时，对底物还具有高度的 特异性，可以专一性地切割 X-Arg-Gly 或 Gly-Arg-X 序列中由精氨酸羧基参与形成的肽键。 [3] 由于凝血酶具有以上的特性，近年来使其成为一种新型的速效局部止血药，在临床上 被广泛应用于消化道出血和外科手术止血。[1]此外，利用其作用的特异性，还可作为工具酶 用来加工目的产物，在医学和生物学研究上的用途也很广泛。 现在，制备凝血酶的原料多为牛、猪和人的血浆。我国猪血的来源相当广泛，随着开 发利用猪血的意识逐渐提高，有关猪凝血酶提取方法的文献报道也越来越多。目前，凝血酶 [1] 的制备方法主要有柠檬酸钡吸附法、氢氧化镁吸附法和等电点沉淀法 3 种。 其中等电点沉 淀法是最简单易行的分离方法，也是后续纯化工作的基础。凝血酶的等电点在 5.0～5.5 之间 [1]，但物种之间是有差异的。已有报道显示，将猪血浆采用适宜的稀释度稀释后，用 1%或 2%冰醋酸调 pH 至 5.0~5.3，可将猪凝血酶原粗制品沉淀出来。[2][4][5][6] 在我国，牛血的来源也是比较丰富的，因此从牛血中提取凝血酶也具有一定的社会意 义。欲利用等电点沉淀法得到牛凝血酶的粗制品，需预先得知其等电点。虽然已有文献报道， 将牛血浆稀释 10 倍后，用 2%冰醋酸调 pH 至 5.0~5.3，可沉淀出牛凝血酶原[7]，但其等电点 的准确值在文献中尚未见报道。 随着系统生物学和蛋白质组学的迅速发展，作为其主要的研究手段之一的电泳，应用 范围越来越广泛和普遍。等电聚焦（Isoelectric Focusing, IEF ）电泳技术，凭借其高分辨率 等优点，现已成为一种被广泛采用的蛋白质分析和制备技术。它不仅可以测定蛋白质的等电 点，分离混合的蛋白质，而且与 SDS组成双向电泳后可大大提高分离蛋白质的能力。 因此，可以采用双向电泳的方法（第一向：IEF ，第二向：SDS），测定牛凝血酶的等 电点。根据凝胶过滤法的测定，牛凝血酶的相对分子质量为 37 kDa，由两条多肽链通过一 个二硫键相连，A 链为 5kD，B 链为 32kD 。[2]这样就可以在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶中确定牛 凝血酶的条带，从 IEF 中得知其等电点。等电点测定后，使得采用等电点沉淀法获取牛凝血 酶粗制品时纯度更高，有利于纯化操作和研究其功能，以及其它相关研究工作的进行。 2.等电聚焦基本原理 1本课题得到学校“211 工程”基金资助。 -1- 等电聚焦(Isoelectrofocusing, IEF)是 1966 年由瑞典科学家 Harry Rilbe 和 Olov Vesterbery 建立的一种高分辨的蛋白质分离分析技术。它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的 不同在