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膜片钳技术讲座 哈尔滨医科大学生理学教研室 李玉荣 在《膜片钳技术及应用》（2003）一书的序言中写道： 通常，一篇非常专业的科技论文公开发表后，若被其他的论文引用数次，其作者就会感到欣慰；假如被别的作者引用十次以上，就可称得上是一篇好论文；要是有幸被引用几十上百次，甚至几百次，那它无疑是一篇高质量杰作，通常发表在权威的专业期刊或者是著名的科学杂志上，如“Nature” ，“ Science”， “ Cell”和“ Neuron”等。 然而，你是否知道？有一篇论文，它的作者当时还不太有名，刊登的杂志也不算顶级，可是论文发表20年来，已神话般地被世界各地的科技工作者引用了一万二千余次，遍及生物医学的众多领域，而且近年来还在以平均每年约一千多篇的速度继续被引用，它就是由Hamill，Marty，Neher，Sakmann和Sigworth等五人于1981年发表在《欧洲生理学杂志》上的著名论文Improved Path-Clamp Technigues for High-Resolution Current Recording from Cells and Cell-free Membrane Patches。在此之前五年，身为德国科学家的Neher和Sakmann共同发明了膜片钳技术（1976），并于15年后共同荣获1991年诺贝尔 生理学或医学奖。 目 录 一、离子通道的概念 二、离子通道的分子结构 三、离子通道的分类 四、离子通道的研究技术 五、膜片钳实验方法 六、膜片钳改良模式及其它研究方法 一、离子通道的概念 离子通道（ion channels）是镶嵌在细胞膜脂 质双分子层上的一种 特殊整合蛋白，在特 定情况下，形成具有 高度选择性的亲水性 孔道，允许适当大小 和电荷的离子以被动 转运的方式通过。 离子通道具有两大共同特征，即离子选择性及门控特性。选择性包括通道对离子大小的选择性及电荷选择性，如安静时神经细胞膜离子通道对K+的通透性比Na+大100倍，而神经兴奋时，对Na+通透性又比K+大10~20倍。通道闸门的开启和关闭过程称为门控（gating）。通道可表现为三种状态，即备用、激活及失活状态。 二、离子通道的分子结构 随着生物物理学和分子生物学的迅速发展，新的研究技术的应用，特别是膜片钳片技术与分子克隆、基因突变和异体表达等技术的结合，使离子通道的研究迅速进入到分子、亚分子水平，人们已开始有能力从分子水平来确定通道的分子结构和解释离子通道的孔道特性。 １．电压门控离子通道的基本结构 经纯化、克隆和测定表明，离子通道蛋白是由多个亚基构成的复合体。电压门控离子通道由α、β、γ、δ等亚基构成，但不同的离子通道的组成略有差异，如钠通道由α、β1 、 β2和β3 、 β4亚基组成，钙通道由α1、α2、β、γ和δ亚基组成，钾通道由α和β亚基组成等。在各亚基中，α亚基是构成离子通道的主要功能单位，而其它亚基则主要起调节作用。 α亚基是一条跨膜多肽，由1800 ~ 2000 个氨基酸组成。它包括四个跨膜结构域（Ⅰ~Ⅳ），每个结构域含有6个α螺旋片段（S1~S6）,除S4为亲水性跨膜螺旋片段外，其余5个均为疏水性跨膜螺旋片段。位于S5和S6间的一段氨基酸序列部分贯穿膜内，是形成亲水性孔道而使离子选择性通过的部分称为孔道区（pore region）或P区，四个结构域围绕一个中心对称排列，P区在内组成孔道内壁。S4肽段含有一些带正电荷的氨基酸残基（如精、赖氨酸），对膜电位的变化敏感，起电压感受器的作用。 当膜去极化时，每一个功能区的S4肽段做螺旋运动而使正电荷移出产生微弱而短暂的门控电流，导致通道构象变化。当四个结构域S4肽段均发生这种构象变化时，则通道便处于激活开放状态，因此，S4肽段又称为激活闸门（activation gate, m闸门）在通道开放后，很快Ⅲ结构域的S6与Ⅳ功能区的S1之间的肽链构成失活闸门（inactivation gate, h闸门），形成一“活瓣”，将通道内口阻塞，调控通道的失活过程。 ２．化学门控离子通道的基本结构 当各种化学物质与化学门控离子通道相应部位结合后，会导致通道蛋白发生构型变化，引起通道开放，产生离子电流。体内这种离子通道的种类很多，主要包括各种神经递质门控离子通道、ATP敏感钾通道和钙依赖性钾通道等。 神经递质门控离子通道又称为离子通道受体，主要有乙酰胆碱门控离子通道、GABA门控离子通道及谷氨酸门控离了通道三大类。 乙酰胆碱门控离子通道 由α1γα2βδ 五个亚基组成，呈五边形排列。每个亚基有4个跨膜区段即M1~4，由五个亚基的M2共同构成孔道的内壁