禽流感病毒多重荧光RTPCR检测技术的建立与初步应用-期刊.pdfVIP

家禽传染病 488bp 一步说明该多重RT-PCR具有高度特异性。 图2略敏感性试验结果显示，该多重RT-PCR对AIV 皿型A1V RNA．说明该多重RT-PCR是具有高灵 RNA的最低检测量均为100pg。检测到如此微量的AIV 敏度的病原检测诊断方法，不需要对病原体进行分离繁殖，就可对临床疑似AIV感染的样品或环境样品进 行直接检测鉴别，避免了传统方法进行AIV实验室分离繁殖过程中存在的感染、散毒和传播等风险。 值。 参考文献略 禽流感病毒多重荧光RT—PCR检测技术的建立与初步应用 张鹤晓1，3，徐虹2，杨汉春3，高志强1，谷强1 (1·北京检验捡疫局，北京朝阳100029；2．中国疾病预防控制中m病毒病预防控制所，北京宣武 100052；3．中国农业大学动物医学院，北京海淀100094) 双水解探针。建立了检测H5／H7和H5／N1 2种多重荧光PCR技术，实现了一次反应对样本中禽流感病毒 的快速检测和定型，并分别进行了敏感性和特异性试验。结果显示所建立的方法特异性强，检测感染鸡胚 重荧光RT-PCR与HI和NAI试验结果完全一致。 关键词：禽流感病毒；多重荧光RT-PCR：初步应用 禽流感病毒是由正黏病毒科流感病毒属的A型流感病毒引起的一种禽类感染。而且A型流感病毒是唯 一能引起禽鸟感染的正黏病毒。根据血凝素和神经氨酸酶的抗原差异性，可将A型流感病毒分为不同亚型， 性感染，只有少数H5和H7亚型禽流感病毒具有迅速传播和高致死性的特性．引发高致病力禽流感 (HPAI)。OIE将其列为A类传染病，我国也将其列为一类检疫性对象。 第六次全国会员代表大会暨第11欢学术研讨会 国内外检测禽流感病毒最常用和经典的方法是鸡胚病毒分离，该方法是OIE推荐的方法，但是耗费时间 长。为缩短检测时间，目前我们已成功建立了灵敏、特异的荧光RT-PCR检测方法，并已经应用于活禽、禽 禽流感瘦情。以及高致病力禽流感通常由H5和H7亚型引起而需要在平时的监测中特别警惕，囚此在平 时疫情检测和实施扑灭措旅时对这些病毒亚型进行快速检翘J和定型非常重要，在本研究中，为能在这些特 现了在一次反应中对样本中的病毒进行快速定型。并对这两种多重检测方法进行了敏感性和特异性评价， 进而用于临床样品的检测。并与经典的鸡胚病毒分离、血凝抑制试验及神经氨酸酶抑制试验进行了比较。 1材料与方法 · 1．1材料 肝炎病毒，本实验室收集。 1．1．2 SPF鸡胚购自北京实验动物中心。 1．1．3主要试剂Taq PharmaciaBiotechlnc产品。 1．1．4荧光PcR仪分别为Roehe和ABI公司产品。 1．2方法 ． 1．2．1HA及NA引物和探针的设计合成对于H5和H7亚型特有引物和探针仍采用以前的研究中筛 的反应条件，选择保守序列进行引物探针的设计，共设计合成了下面三对引物和两条探针，NA引物名称 分别为NIUI／NIRl；N1U2／NIR2和N1U3／NIR3，探针名称为Nl和N2。 1．2．2 N1亚型特有引物与探针的筛选将上述N1亚型特有上游引物、下游引物及结合探针进行配对 试验。应用前面优化后的扩增反应参数、反应体系对设计的引物探针不同组合进行扩增，比较，以期筛选 山适合此反应条件的检测Nl亚型禽流感病毒的探针和引物。 对引物和探针不同浓度的配比进行了比较，并对反应体系和反应参数进行筛选优化。两种检测探针分别用 不同的荧光基团进行标记，其中检测H5引物扩增片段的探针用FAM标记，而检测Nl引物扩增片段的探 针用TET标记。 进行扩增，每组均采用复管进行试验。 一份经绒毛尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每天观察两次。 1．2．5 。 观察是否出现假阳性反应。 · 行正交试验。对引物和探针不同浓度的配比进行了比较。并对反