六氯苯和雌二醇共存时内分泌干扰活性拮抗效应和其机制探究.doc

六氯苯和雌二醇共存时内分泌干扰活性拮抗效应和其机制探究 　　摘要：以典型天然雌激素雌二醇为代表，以人体乳腺癌细胞MCF-7增殖为手段，检验了六氯苯与雌二醇共同作用时的内分泌干扰活性及其机理.结果发现六氯苯具有强烈的内分泌干扰活性，但与雌二醇混合后，呈现明显的拮抗效应，内分泌干扰活性被显著抑制.机理分析表明六氯苯、雌二醇、二者混合物都可以干扰雌激素受体和胞外信号调节激酶（ERK）信号通路、激活转录因子、诱导细胞增殖.路径分析表明，六氯苯与雌二醇的拮抗作用与雌激素受体通路无关，主要原因是雌二醇降低了六氯苯对ERK的活化程度、降低了p-ERK蛋白的表达、从而干扰了丝裂原活化蛋白激酶信号转导.转录因子分析表明，雌二醇弱化六氯苯内分泌干扰活性的主要原因是降低了c-Myc蛋白表达.上述发现为六氯苯的控制提供了理论依据. 关键词：雌二醇；六氯苯；雌激素活性；拮抗；ERK信号通路；机理 中图分类号：X703.1 文献标识码：A 内分泌干扰物（EDCs）具有生物内分泌干扰活性、可破坏免疫系统、引起多种器官和神经损伤，是目前国际研究热点[1].我国多地检出多种EDCs，其典型代表是六氯苯（HCB）[2].环境中的六氯苯进入生物体后，必然与天然雌激素共同发挥作用.而这方面的研究未见报导. 研究发现，有的物质混合时出现明显的协同作用，如Dieldrin，Toxaphene，Endosulfan和Chlordane任何两种混合，雌激素反应强度可增加160～1 600倍[3].双酚A、异黄酮、壬基酚在低浓度下也出现明显协同[4-5].与此同时，也有报道发现狄氏剂和毒杀酚混合后雌激素效应无协同作用[6]；而镉与E2之间甚至出现了拮抗作用[7].上述现象表明不同EDC的混合效应不同、作用机制不同，需要逐一研究.本文选择天然雌激的代表雌二醇（E2），研究它与六氯苯共同作用时的内分泌干扰活性及其作用机制. 1材料与方法 人体乳腺癌细胞MCF7来自哈尔滨工业大学生物系，属ATCC细胞系.酶与蛋白标样购自美国Sigma公司.化学试剂购自美国Ameresco公司.根据六氯苯的毒性检测结果和生物体内E2浓度，单独投加六氯苯浓度为10-8 mol/L，单独投加E2的浓度为10-12mol/L，混合物的浓度为二者各取一半.所用主要设备包括GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems公司），DYY6B电泳仪（北京市六一仪器厂），蛋白质电泳及Western杂交转膜系统（BioRad），LSM Meta510 激光共聚焦仪（Zeiss公司）和IGO 150二氧化碳培养箱（Thermo公司）. 雌激素活性检测采用经典EScreen法，细胞增殖效应（PE）为实验组的吸光度平均值与溶剂对照组吸光度平均值的比值[2]. 采用WESTERN BLOT法测定乳腺癌MCF7细胞内雌激素受体α蛋白，以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路相关蛋白.该方法可检测到低至10pg的EDC干扰效应[8].以βTublin蛋白作为内参照，对目的蛋白表达量进行校正[9].采用RTPCR法测定EDCs干扰效应相关的转录因子，具体步骤为：细胞培养、RNA抽提、分离、沉淀、洗脱、再溶解、定量、逆转录、聚合酶链式反应、电泳鉴定[2]. 每次试验均进行三组平行试验，每组平行实验设定6个平行样，共18个样品，最终实验数据经SPSS13.0方差分析进行处理. 2 结果与讨论 2.1六氯苯与雌二醇混合后内分泌干扰活性研究 首先考察E2与六氯苯的混合对其内分泌干扰活性的影响，结果见图1.图1表明六氯苯明显促进MCF7细胞增殖效应，E2在48 h时的细胞增殖效应最强，96 h时二者均失去增殖效应.二者混合后产生明显的拮抗效应，在24 h时甚至比溶剂对照组弱.这一现象十分重要，意味着天然雌激素对六氯苯的内分泌干扰活性存在强烈的抑制，可以有效消除其内分泌干扰活性，对于保护生物体内分泌系统稳定具有重要作用.本文的结果来源于单一浓度实验，这一拮抗现象并非决定性的结论，不同实验条件下二者的混合效应需要进一步的实验验证. 2.2内分泌干扰活性路径分析 接下来研究E2，六氯苯、两者混合物的内分泌干扰活性路径.EDCs干扰内分泌系统活动的路径有多种.其中最常见的是与生物体内的雌激素受体（ER）结合，阻止天然雌激素作用，被称为经典路径；此外，EDCs还可以通过非经典路径如MAPK通路发挥作用.本文同时考察了二者. 2.2.2非经典路径分析 图2表明经典路径不是E2抑制六氯苯的路径，拮抗效应可能通过MAPK信号通路起作用.MAPK信号通路中最重要的一条是外界因子激活细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）[10]，