应用TaqMan探针技术检测MTHFR基因C677T与A1298C多态性.docVIP

应用TaqMan探针技术检测MTHFR基因C677T与A1298C多态性 　　摘要：目的 探讨一种快速、准确运用于临床检测MTHFR基因多态性的方法。方法 提取43例胃癌患者的外周血基因组DNA，用TaqMan探针技术对MTHFR基因的C677T和A1298C两个多态性位点进行分型，并采用直接测序法对TaqMan探针分型结果进行验证。结果 43例样本的MTHFR C677T基因型分别为14例CC、23例CT和6例TT；A1298C基因型为24例AA、18例AC、1例CC，两种分型方法结果一致。结论 本研究选用的TaqMan探针分型方法结果准确可靠，能够用于MTHFR的C677T和A1298C两个多态性位点分析。 关键词：TaqMan探针；MTHFR；多态性；DNA测序；胃癌 胃癌（Gastric cancer）是世界范围内的高发肿瘤之一[1]。近年研究表明，低叶酸水平可增加包括胃癌在内的许多肿瘤发生的危险性[2]。亚甲基四氢叶酸还原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）是叶酸代谢途径中的一 关键酶，MTHFR参与的体内同型半胱氨酸（Hcy）和甲硫氨酸之间的循环反应，反应中生成的S腺苷甲硫氨酸（SAM）是体内代谢唯一的甲基供体，涉及DNA的修复与合成，影响DNA代谢，与许多肿瘤化疗药物的疗效相关。 MTHFR的活性很大程度上可能受基因多态性的影响，从而影响疾病的发生和药物的疗效。MTHFR基因C677T和A1298C为两个常见的多态性位点，有研究表明该位点的基因多态性会导致MTHFR酶活性的改变[3]，可能导致患者之间出现较大的个体差异。因此，测定MTHFR的基因型对疾病的预防和合理用药有重要的意义。现已有的MTHFR基因多态性的研究，大多数采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术，该技术不仅费时，且易污染造成假阳性。不适宜用于临床检测。本研究旨在探讨一种可用于临床快速准确检测MTHFR基因型的方法，故选用TaqMan探针技术对MTHFR的C677T和A1298C两个多态性位点进行分型。 1资料与方法 1.1一般资料 经CT、MRI或病理组织学活检确诊的胃癌患者43例，来源于昆明医科大学第一附属医院，收集样本人群的外周静脉血2 mL。采用Genomic DNA Purification Kit（PROMEGA公司）对基因组DNA进行提取，使用Nanodrop 2000测定DNA的浓度和纯度。 1.2 TaqMan探针技术检测MTHFR基因C677T和A1298C位点的多态性 TaqMan探针试剂由ABI公司为MTHFR基因C677T（SNP ID：rs1801133），A1298C（SNP ID：rs1801131）多态性设计的TaqMan SNP分析试剂，每个位点的TaqMan SNP基因分型试剂中，含有两条MGB探针。MTHFR C677T一条以VIC荧光标记碱基G，对应样本基因突变位点C；一条以FAM荧光标记碱基A，对应样本基因突变位点T。MTHFR A1298C一条以VIC荧光标记碱基G，对应样本基因突变位点C；一条以FAM荧光标记碱基T，对应样本基因突变位点A。探针序列，见表1。 MTHFR C677T及A1298C多态性 real-time PCR采用25 μL反应体系：40×SNP Genotyping Assay Mix：0.625μL；TaqMan 2×PCR Master Mix：12.5 μL；DNA模板：1 μL；dd H2O：10.875 μL。探针检测在BIO-RAD IQ5实时荧光PCR仪上进行。反应条件为：95℃预变性10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，共40个循环。由于仪器的限制，本研究使用的BIO-RAD IQ5实时荧光PCR仪中没有VIC荧光检测通道，我们选择了HEX荧光通道替代，两种荧光相差1nm波长。 1.3 DNA测序法验证TaqMan探针技术检测MTHFR基因多态性 1.3.1目的片段的扩增 设计MTHFR C677T及A1298C两个多态性位点的测序引物（Invitrogen公司合成），引物序列，见表2。 2结果 2.1 Taqman探针基因型分析 MTHFR C677T和A1298C real-time PCR散点图基因分型结果分别，见图1、图2。 2.2 DNA测序验证 采用Lansergene SeqMan软件分析测序结果。 2.3 MTHFR基因多态性分型结果 43例样本MTHFR C677T基因型分别为野生纯合型CC 14例（32.5%）、突变杂合型CT 23例（53.5%）及突变纯合型TT 6例（14.0