酵母菌药敏标准操作规程.docVIP

酵母菌MIC检测标准操作规程（微量液基稀释法） 编 号： 页 数： 制订人：（签名） （日期） 审核人：（签名） （日期） 批准人：（签名） （日期） 颁发日期： 生效日期 培养基配置： RPMI 1640 培养液：RPMI1640（Gibco BRL，Invitrogen）10g，NaHCO3 2.0g，吗啉基丙磺酸（morpholinepropanesulfonic acid, MOPS, Sigma）34.5 g（0.165 M），加三蒸水 900 ml 溶解，1 M NaOH 调 pH 至 7.0（25℃），定容至 1 000ml，过滤除菌，4℃保存。 沙堡葡萄糖琼脂培养基（sabouraud dextrose agar, SDA）：蛋白胨 10g，葡萄糖 40g，琼脂 18g，加三蒸水 900 ml 溶解，加入 2 mg/ml 氯霉素水溶液 50 ml，调整 pH 至 7.0，定容至 1 000 ml，115℃，高压灭菌，4℃保存。 抗真菌化合物的配制： 待筛选化合物统一用DMSO溶解，配成6.4mg/ml母液，-70℃保存； 药敏板制备前将50μl母液加入到450μl RPMI 1640 培养液中，充分振荡混匀，稀释为640μg/ml 中间浓度备用。 药敏板制备： 取无菌 96 孔板，于每排 1 号孔加 RPMI 1640培养液200 μl 作空白对照； 96孔板每排3～12 号孔各加RPMI 1640培养液100 μl； 2 号孔分别加RPMI 1640培养液180μl 和640μg/ml 抗真菌化合物溶液20 μl，充分混匀；每排为1个待筛选化合物；最后一排为质控氟康唑； 2～11 号孔10 级倍比稀释，使各孔的最终药物浓度分别为 64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和 0.125 μg/ml，各孔中 DMSO 含量均低于 1％；12 号孔不含药物，作阳性对照； 药敏板配好之后如不立即接种真菌则必须用保险塑料袋封好，储存于-70℃。 阳性对照药浓度配置： 氟康唑和氟胞嘧啶为水溶性药物，其母液用无菌蒸馏水配置；两性霉素、咪康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑、特比萘芬等为脂溶性药物，其母液用DMSO溶解； 氟康唑、氟胞嘧啶母液配置浓度为1280μg/ml，两性霉素、酮康唑、咪康唑、特比萘芬、伊曲康唑母液配置浓度为1600μg/ml； 所有抗真菌药物母液-70℃保存； 氟康唑、氟胞嘧啶药敏板稀释浓度为：64-0.125μg/ml； 两性霉素、酮康唑、咪康唑、特比萘芬、伊曲康唑药敏板稀释浓度为：16-0.313μg/ml； 菌株准备： 将受试菌株于SDA平皿上活化2次，以保证其活力； 将活化菌株划线接种于SDA平皿，35℃培养24小时； 挑取直径1mm的菌落5个，将其溶解于灭菌三蒸水中，于振荡器上震荡15秒制备成菌悬液； 用血细胞计数板将菌悬液浓度用RPMI 1640培养液调整至1×106~5×106(相当于麦氏浊度0.5)CFU/ml 计算公式：菌液浓度=5个中方格内细胞数×5×104 将上述已经配置好的菌悬液用RPMI 1640培养液稀释1000倍(首先稀释50倍，然后稀释20倍)，使其浓度介于1×103~5×103 CFU/ml之间。 接种 菌悬液稀释至1×103~5×103 CFU/ml之间后，用多道移液器将菌液接终至96孔板第2~12号孔，最终接种浓度为0.5×103~2.5×103 CFU/ml；96孔板最后一排为质控菌株近平滑念珠菌ATCC22019。 培养： 新型隐球菌孵箱中孵箱中35℃培养72小时后观察结果，其他念珠菌35℃培养24小时后观察结果。 结果判读： 吸光度测定判断法 酶标仪检测96孔板吸光度值，与阳性对照相比吸光度值下降80%为该化合物的最低抑菌浓度（MIC）； 与阳性对照相比吸光度值下降80%为唑类药物、氟胞嘧啶和棘白霉素类药物的最低抑菌浓度（MIC）； 与阳性对照相比吸光度值下降100%为两性霉素的最低抑菌浓度（MIC）。 肉眼结果判定: 读取MIC 值时，应当在阅读镜的辅助之下，将每个受试孔中真菌的生