离子对层析.PDF

半製備高壓液相層析儀 (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) 管理人: 周三和 教授 主講人: 黃嘉嘉 博士 設置地點: 生科大樓806室 層析定義 層析法：利用化合物在兩相間分配係數不同而進行分離的 技術 流動相：攜帶樣品流過整個系統的流體 固定相：靜止不動的一相，層析柱 層析是一種分離技術 層析的主要目的是對混合物中的目標 物分離和定量 HPLC適用 1.半揮發性化合物 2.非揮發性化合物 3.樣品沸點過高 4.不宜加溫而不便使用氣相層析儀者的待測物 應用此方法進行分析的先決條件是待測物必須溶於作 為流動相的溶劑中 HPLC可用於 1.液相樣品的定性及定量分析 2.製備純品之用途 HPLC 應用  1. 脂溶性維他命，膽固醇(steroids) ，脂質(lipids)分析。  2. 水溶性維他命，碳氫化合物，酸類分析。  3. DNA 族群：如核酸(nucleic acids) ，核甘(nucleotides)以及 RNA/DNA 等之分析工作。 4. 蛋白質家族：胺基酸，蛋白質，胜肱(peptides) 。  5. 臨床藥物監測，毒物學，法醫學等之分析工作，例如毒品， 麻醉藥劑，新陳代謝。  6. 環境監測及工業上制程之控制等，如環境中之胺基甲酸鹽農 藥等之分析工作。 HPLC簡易流程圖 HPLC優點 分離性能好 靈敏度高 (10-9 〜10-12 g) 選擇性高(同分異構 ，旋光異構) 分析速度快 進樣量小 (1-100 µL) HPLC分類  正相層析 ：分離在水中絕對不溶解的物質或同分異構體，占10%應用  反相層析 ：用於常規分析，占~80%的應用。  離子對層析 ：可看作是反相層析的一個特殊應用，需要在流動相中加入離 子對試劑。  離子交換層析 ：需要特殊的管柱和檢測器，與離子對層析的應用範圍相同 但原理不同  體積排阻層析 ：大分子先流出，小分子後流出。不同的管柱分離的分子量 範圍不同。需要專門的軟體。  水相流動相 ：凝膠斥濾層析GFC (Gel Filtration Chromatography)  有機流動相 ：凝膠透析層析GPC (Gel Permeation Chromatography) Normal-Phase HPLC 在正相層析法中，則是以非極性為流動相，固定相為高極 性 ，極性小的樣品成分會 先被沖提出來，極性大的較慢沖 提出來，因而達到分離效果 Reversed-Phase HPLC 在逆相層析法中，通常以高極性作為流動相，固定相為 非極性 ，極性大的樣品成分會 先被沖提出來，極性小的 較慢沖提出來，因而達到分離效果 優化水相（緩衝液）和有機相的比例非常重要 甲醇、乙腈和THF是常用的有機溶劑。 在有緩衝液的情況下，緩衝液的濃度和pH值非 常重要。 流動相極性變化對分離的影響 20 % 水 30 % 水 40% 水  1 : 對羥基苯甲酸甲酯  2 : 對羥基苯甲酸乙酯  3 : 對羥基苯甲酸丙酯  4 : 對羥基苯甲酸丁酯  有機相: 甲醇 梯度洗脫： 優點：可提高分離度、縮短分離時間、降低最小檢測量和 提高分離精度 注意事項： 溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現性差 梯度混合的溶劑互溶性要好 梯度洗脫應使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器 （如紫外吸收檢測器或螢光檢測器），而不能使用對流動 相組成變化敏 六通切換閥 (6-Way Switching Valve) 聚醚醚酮 (PEEK) pump