基因工程人组织激肽释放酶原的分离纯化.PDFVIP

维普资讯 综述 ‘生命科学仪器 2005第3卷 ／第6期 基因工程人组织激肽释放酶原的分离纯化 赵久阳 一，程谦 ，郑彦z，杨青。，徐茂兰3，张玉奎3 (1．大连医科大学 ，附属第二医院，大连 ，116023 2．大连大学医学院附属医院，大连，116020 3．中国科学院大连化学物理研究所，国家色谱中心，大连，116023) 摘要 发展了一种基因工程人组织激肽释放酶原的分离纯化方法 ，首先对样品采用离子交换的分离模式进行初分离， 进一步通过疏水作用色谱和体积排阻色谱进行纯化。新发展的方法样品的回收率超过50％，而且产品的纯度高，生产成 本低，非常适宜于在规模化生产中应用。 1 引言 2 试验部分 随着基因工程技术的发展和不断完善，大量的 2．1 仪器与试剂 蛋白类产品已能够采用基因工程的方法进行生产。 16mm ×20cm玻璃填充柱，16mm ×80cm玻璃 色谱技术具有极强的分离能力，在分离过程中不会 填充柱，购 自北京来亨公司；DEAE—SepharoseFF离 有害物质，并且设备较为简单，便于进行 自动化控 子交换填料，Phenyl—SePharoSe6B疏水填料 ， 制，因此，在生物样品的分离纯化过程中已经被广泛 Sephacryls一200分子筛填料，美国pharmacia公司； 应用。有关色谱方法在蛋白质分离中的应用报道很 miniplus3蠕动泵，法国Gilson公司；P200Ⅱ型高压 多[】_5_l，每种蛋白质都有针对其 自身特点的优化制备 恒流泵，UV200Ⅱ型紫外可变波长检测器，大连依利 色谱分离方法。 特分析仪器有限公司。 人组织激肽释放酶 (HUK)是一组糖蛋 白，属于 HUK标准品、Anti—HUKIgG美国南卡医学院赵 丝氨酸蛋白酶家族下的一个亚类 ，在人体的许多部 里立教授提供。Na2HPO4、NaH2PO4、NaCI、NaOH 位广泛表达。真核细胞表达的人组织激肽释放酶中 等盐类均为分析纯 ，购 自大连沈联化学试剂玻璃仪 既有生物活性的HUK，也有没有生物活性的组织激 器有限公司；实验中所有使用的溶剂均为分析纯或 肽释放酶原 (proHUK) 【。传统的实验室分离纯化 色谱纯。 PrOHUK方法是将重组酶原经离子交换柱后用 2．2 实验方法 Trypsin切割，然后再用亲和层析的方法进行分离； 2．2．1Bio—HUKIgG的制备 或经离子交换、分子筛后再经高速离子交换、分子筛 取0．5mlHUKIgG(4．6mg／m1)加人到0．5mlPBS中， 等多步分离_7’。在大量制备样品时用Trypsin切割 混匀后用注射器将其注人到卡式透析膜中。将透析膜 的条件较难于控制 ，此外，在临床应用时可以直接将 放人 lO00ml0．1MNaHCO。(pH9．5)溶液中，在4cI= proHUK注人动物或人体内，然后靠体内自身的切割 下透析。24h后取出透析膜，用注射器将透析后的HUK 酶将其切割成具有生物活性的HUK。组织激肽释放 IgG吸出加人到lml的EP管中，再向其中加人 1O l 酶原的高效制备方法发展可以为进一步进行药物的 新鲜配制的0．1M生物素一N一羟基琥珀酸亚胺酯 实际生产奠定基础。本文基于前期的工作积累发展 (BNHS，lOmg／lmlDMSO)。23oC水浴 1h后重