发酵技术-天津大学研究生e-Learning平台.PPT

* * 开题报告 林福建 天津大学化工学院 2013-06-28 鼠李糖脂（RL）产生菌O-2-2的基因改造 一、RL的研究近况 二、RL代谢通路以及相关基因 三、发表文章中已使用的技术手段 四、拟开展工作 五、拟采用的技术路线 一、RL的研究近况 1、国内外产业化现状 产量 技术 工业化 国内 最高产量在20g/L左右 发酵周期一般一周左右，发酵液中分离RL复杂、生产成本高。 大庆沃太斯鼠李糖脂发酵液年生产能力为1.2万吨， 年产500t鼠李糖脂干粉。是目前国内最大工业生产线 国外 产量普遍可达10~30g/L 发酵多采用各类植物油作为碳源。 Rhamnolipid Inc.但无工业化报道。 2、技术发展状况 发酵技术：发酵方式上有传统的液态发酵以及较为新的固态发酵、 泡沫发酵等。采用生产菌种多为自行分离出的铜绿假单胞杆菌，野生菌产量与通过诱变、分子改造菌株相比较低。所选择的碳氮源为植物油和硝酸盐时RL产量提高。具体发酵工艺上，限制氮源浓度来获得最大产物产出率最常见，最佳C/N一般从8~52不等。发酵方法上研究最多的还是液态发酵，只是基于各个亚种的性状改变其发酵条件，如限制某些底物浓度，维持偏酸性的pH，流加操作提高发酵产量等。 德国专利最新报道新的铜绿假单胞菌种DSM7107和DSM可以生产高浓度的鼠李糖脂70~120g/L（96年）。最近没有高产鼠李糖脂的专利。 2、技术发展状况 分离技术：传统发酵液分离技术主要有离心分离、萃取分离和过滤分离。对于RL主要有两类分离方法：1）经典分离法：包括离心、沉淀、萃取等。通常步骤为离心除菌体后，用乙酸乙酯等有机溶剂萃取上清液。通过旋转蒸发蒸干溶剂即得到RL粗品。2）随程提取法：即在发酵的同时耦合分离工艺，包括泡沫分离、酸解聚沉、树脂吸附等。 3、RL研究的主要方向 二、RL代谢通路以及相关基因 二、RL代谢通路以及相关基因 此代谢通路中，关键步骤为RhlA（鼠李糖基转移酶1链A）催化下HAA的合成（β-羟基烷酰基-β-羟基烷酸）；RhlB（鼠李糖基转移酶1链B）催化下dTDP-L-鼠李糖作为糖供体，HAA作为受体的合成单糖双酯的反应；RhlC（鼠李糖基转移酶2）催化下在鼠李糖基的2号碳上连接一个鼠李糖从而合成双糖双酯的反应。 除此之外，dTDP-L-鼠李糖的合成在细菌细胞中原本就存在，HAA合成的前体物质合成也存在。并且不是影响RL合成的主要因素，因此这些步骤不需进行设计改造。 三、发表文章中已使用的技术手段 加拿大威尔夫大学Rahim等人在“Cloning and functional characterization of the Pseudomonas aeruginosa rhlC gene that encodes rhamnosyltransferase 2,an enzyme responsible for di-rahmnolipid biosynthesis”（01years）中提到：双糖双酯是在rhlC催化下在单糖双酯上再连接一个鼠李糖。rhlC是一个分子量为35.9kDa由325个氨基酸组成的蛋白质酶，为了确定RhlC的生物功能，经插入突变和等位置换获得的突变菌株RTII-2不能产双糖双酯但是能够产单糖双酯，同时获得PAO1-rhlA突变株（rhlA基因被破坏），其既不能产生单糖双酯又不能产生双糖双酯。经转入含有rhlC的质粒后的RTII-2则恢复了与野生型PAO1相同的产双糖双酯水平，并进一步研究了rhlC的操纵子的组成。 三、发表文章中已使用的技术手段 山东大学的李清心博士毕业论文“鼠李糖脂合成酶RhlA和RhlB基因的克隆、表达、纯化及在石油微生物中的表达和应用研究”（2005年）：该文章分别将RhlA和RhlB用高表达的系统pET在大肠杆菌中进行了表达。其中，RhlA是一个分子量为33kDa的蛋白，在大肠杆菌内表达了含有6个组氨酸（His-tag）的重组RhlA蛋白，然后，通过亲和层析和FPLC分子筛层析的方法对其进行了纯化，并通过蛋白质印迹的方法，用特异性的检测6个组氨酸的单克隆抗体证明了所纯化的蛋白是正确的。 利用电转化的方法将含有RhlAB的pVLT质粒转