农杆菌介导的LEA1基因对拟南芥的遗传转化.PDFVIP

中国科技论文在线 第9卷第4期 西安文理学院学报：自然科学版 VO1．9 No．4 2006年 10月 Journal of Xi’an University of ArtsScience(Nat Sci Ed) Oct．2006 文章编号：1008—5564(2006)04—0031—03 农杆菌介导的 LEA 1基因对拟南芥的遗传转化 包 宇 ，赵咏梅2，俞嘉宁 ，杨建雄 (i．陕西师范大学生命科学学院，陕西西安710062；2．西安文理学院生命科学系，陕西西安710065) 摘 要：将含有 u 1基因的表达载体pBI121．丁nLEA1经根癌农杆菌介导，利用花粉管通道法 转入拟南芥，得T0代种子，抗Kan筛选得转基因植株．经PCR检测，初步证明外源 LEA1基因已整合 到拟南芥基因组中． 关键词：根癌农杆菌； E EA 1基因；花粉管通道法 中图分类号：Q343．1 文献标识码：A u、A蛋白是指胚胎发生后期种子中大量积累的一系列蛋白质，它广泛存在于高等植物中，且受发 育阶段、脱落酸( )和脱水信号的调节[卜3I． u 基因是由俞嘉宁等(1999)以小麦第3组U 蛋白基因的保守序列设计引物经扩增回收克隆出的新基因，GeneBank注册号：AY14890．用TaLEA 做 探针，对渗透胁迫下不同耐旱性的小麦幼苗进行了Northern杂交分析．结果表明耐旱品种中u、A表达 量一般高于不耐旱品种，说明TaLEA 基因的表达与所测品种的耐旱性呈正相关．ABA、NaC1、冷处理 等其他非生物胁迫均可诱导U 基因表达，推测TaLEA 基因与植物的耐逆性可能有密切关系l4J． 为了进一步验证该基因的功能，本实验利用已构建好的含TaLEA 全长cDNA的表达载体pBI121 一 TaLEA 对野生拟南芥进行了真空渗透转化，得到T0代种子，经选择培养基筛选，得到阳性植株．提 取阳性植株DNA，通过P(、R技术对阳性植株进行初步验证． 1 实验材料 拟南芥(Arabidopsis thaliana)为哥伦比亚生态型，待转化根癌农杆菌由中国科学院遗传与发育研 究所803组提供． 2 实验方法 2．1真空花粉管通道法转化及阳性植株的筛选 拟南芥播种于土：蛭石：珍珠岩(4：3：1)的混合土中，用营养液每3 d浇1次．温度20～22℃，相对 湿度60％～70％，光照16 h，黑暗8 h． 野生拟南芥培养约1个半月，至茎高3～10 cm时，去其顶生花序，继续生长7～9 d后，即可用于转 化．将阳性农杆菌接种于含利福平和卡那霉素的LB液体培养基中，28℃，200 r／m振荡培养至013600 为1．2～1．8(约需48 h)；离心弃上清，收集菌体重悬于转化液中．将准备好的植株倒置于含转化缓冲液 的玻璃瓶中，抽真空，维持0．05 Mpa压力5 rain，避光侧放24 h，然后按常规方法培育植株至结实，收获 成熟种子(Tn代)． 收稿日期：2006—07—12 基金项目：国家转基因植物研究与产业化开发专项(J2002一B一001) 作者简介：包宇(1982一 )，女，吉林临江人，陕西师范大学生命科学学院硕士研究生 转载 中国科技论文在线 32 西安文理学院学报：自然科学版 第9卷 将T0代种子表面灭菌，均匀散布于含卡那霉素的选择培养基上(平均 1000—2000粒种子／iR)，置 22℃光照16h／d培养．生长 1week后挑选绿色阳性植株 (阴性植株为黄色)，转至正常MS培养基中， 10d后若植株存活且健壮则转入混合土中培养，成熟后分单株收取种子(T1代)． 2．2 PCR验证 取拟南芥Tn代及对照植株叶片组织，用CTAB法提取基