云南红豆杉愈伤组织培养及其生产紫杉醇的研究.doc

云南红豆杉愈伤组织培养及其生产紫杉醇的研究 甘烦远 彭丽萍 郑光植 ( 中国科学院昆明植物研究所 昆明 650204) 从红豆杉科红豆杉属植物如短叶红豆杉 ( T ax us brev i f ol i a) 等的树皮或枝叶提取到的紫杉醇 ( Tax2 ol) 是一种具有强抗癌活性的二萜烯类化合物1 。作为一种治疗晚期卵巢癌 、乳腺癌的新药已经在欧美 等一些国家被批准上市 ,成为迄今从植物中提取的最有效的抗癌药之一2 。但由于紫杉醇在红豆杉中 的含量很低 ,为万分之一左右 ,因此药源来源非常困难3 ,4 。近年来研究取代从红豆杉树皮来提取紫杉 醇的方法如紫杉醇的化学合成 、半合成 ,从真菌中提取紫杉醇以及改善红豆杉的栽培措施等等均已取得 了较大进展 ,但离实际应用还相差太远5 ,6 。而利用组织和细胞培养方法替代砍伐天然红豆杉树皮来 提取紫杉醇 ,也已成为近几年来红豆杉研究的一个重要课题之一并已取得了较大进展7 。 云南红豆杉 ( T ax us y u n n anensis) 主要分布于我国云南省 ,是分布于我国的主要品种之一 ,其含量在 我国现有的几种红豆杉植物中属于较高的一种3 ,在我国 ,近些年来亦有不少实验室在红豆杉细胞培养 方面取得了较好的成绩 ,但文献报道的较少8 ～10 。本文报道利用云南红豆杉细胞培养方法来生产紫杉 醇 ,以最终取代从天然来源的树皮和枝叶中提取的可能性 ,对云南红豆杉进行的愈伤组织的诱导和培养 研究的进展 。 1 材料和方法 111 愈伤组织诱导 供试植物材料云南红豆杉 ( T ax us y u n n anensis) 取自本所植物园 。取其嫩枝条 ( 当年生) 及针叶片 , 清水洗净后 ,滤纸 压 干 , 用 012 %升 汞 消 毒 10min , 于 超 净 工 作 台 上 无 菌 操 作 将 材 料 剪 成 长 约 110 ～ 115cm 的切段 ,常规方法进行愈伤组织诱导 。诱导培养基为 MS、B5 和 6 ,72V 等 3 种固体培养基 ,并附 加不同的植物激素或其组合 。培养基的琼脂粉含量为 016 % ,p H518 左右 ,培养温度为 25 ±2 ℃,于黑暗 中培养 。 112 愈伤组织培养 分离诱导出的愈伤组织 ,于 B5 基本培养基上 ,进行培养基及植物激素的筛选试验 。愈伤组织接种 于含 20ml 固体培养基的 50ml 三角瓶中 ,每个三角瓶接种量约为 50mg ( 干重) 左右 ,愈伤组织每 35d 继 代 1 ?? 。 113 紫杉醇的 HPL C 分析 收集冰冻干燥的愈伤组织 ,甲醇提取 ,提取液蒸干 ,少量水溶解 ,二氯甲烷萃取 ,萃取液蒸干 ,甲醇溶 解 ,定溶后进行 HPL C 分析 , HPL C 分析条件如下 : 岛津 L C23A HPL C 色谱仪 , Sp herisorb C6 H5 ( 10μm ,4 ×250mm) 分析柱 (中科院大连物化所) 。检测波长 228nm 。以甲醇 :乙腈 :水 (2 :3 :8) 为流动相 。 114 细胞生长及紫杉醇的含量测定 培养细胞的生长速率以每天每升培养基增加的细胞干重克数表示 [ ( g/ L . d) , 计算公式如下 : 收获细胞干重 ( g) 2接种细胞干重 ( g) 细胞生长速率 ( g (L . d) - 1) [ g/ L 1d = 培养基体积 (L ) ×培养时间 ( d) 中国科学院“八五”重点科研项目 。 本文于 1995 年 3 月 21 日收到 。 紫杉醇的含量 以 百 分 率 ( %) 表 示 。根 据 进 样 量 与 峰 面 积 的 关 系 , 以 双 点 外 标 法 进 行 紫 杉 醇 的 HPL C 含量测定 。以上实验结果至少 3 次重复 ,结果取其平均值 。 2 结果与讨论 211 愈伤组织诱导 不同培养基对云南红豆杉外植体的愈伤组织诱导有不同的效果 ,在所试验的 B5 、MS 和 6 ,72V 3 种 培养基中 ,以 MS 培养基为佳 (表 1) 。在 MS 培养基上 ,试验了不同植物激素种类及其组合对云南红豆 杉外植体愈伤组织诱导的影响 。结果见表 1 :添加 2 ,42D 或含 2 ,42D 的激素组合 ,对诱导外植体形成愈 伤组织效果较好 。在 MS 培养基中附加 110mg. L - 1 NAA + 1 . 0mg. L - 1 2 ,4 ,2D + 011mg·L - 1 KT 和植物 激素 ,可使云南红豆杉的愈伤组织诱导率达到最高 ,其中嫩枝条的愈伤组织诱导率达到 100 % ,针叶的 诱导率达到 78 % 。外植体接种大约 3 周左右 ,开始形成